ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА

2. Матеріали та методи дослідження

Обстеження на мікрофлору урогенітального-тракту в бактеріологічній лабораторії проводили згідно з Наказом Міністерства охорони здоров’я від 22 квітня 1985р. «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно –профилактических учреждений»

Матеріал для дослідження відбирався до будь-яких лікувальних процедур.

При підозрі на наявність анаеробної інфекції відразу після забору матеріалу тампон поміщався в пробірку з напіврідким тіогліколієвим поживним середовищем[46].

Паралельно зі взяттям матеріалу для посіву готувались мазки для мікроскопії (в кількості двох), використовуючи при цьому окремі стерильні тампони. Мазок висушували при кімнатній температурі, покривали чистими предметними скльцями і відправляли до лабораторії[38].

Взятий матеріал для бактеріологічного дослідження було терміново доставлено до лабораторії.

2.1 Етапи дослідження матеріалу в бактеріологічній лабораторії

Мікроскопічне дослідження.

В лабораторії доставлені мазки з досліджуємим матеріалом фарбували за Грамом і мікроскопірували з імерсійним об’єктивом. Під час мікроскопії відмічали наявність запальних реакцій: наявність лейкоцитів, слизу, фібрину, при виявленні мікроорганізмів відмічали ступінь обсіменіння , відношення до пофарбування за Грамом і морфологічні особливості[38].

Посів матеріалу на поживні середовища

Наступним етапом дослідження був посів доставленого матеріалу на поживні середовища. Для виявлення золотистого стафілококу відібраний матеріал було висіяно на жовтково-сольовий агар (ЖСА).

Досліджуємий матеріал висівали також на середовище Ендо (для обстеження на наявність ентеробактерій), кров’яний агар, середовище Сабуро (обстеження на наявність грибів), цукровий бульйон.

Досліджуємий матеріал, котрий було взято ватним тампоном, засівали цим тампоном, використовуючи штрихову техніку посіву матеріалу, спочатку на половину кров’яного агару потім на ЖСА, Ендо, Сабуро, та посіяли тампоном в цукровий бульйон[38].

Всі посіви поміщали до термостату для інкубації при температурі 37⁰С щоденно перевіряючи наявність росту на поживних середовищах. При появі росту на поживному середовищі підрахували кількість колоній, робили відповідні позначення в робочому журналі, виконували необхідні посіви для видової ідентифікації вирослих колоній[35].

При помутнінні цукрового бульйону, готували мазки та фарбувалиїх за Грамом і у відповідності до отриманих результатів виконували посіви на необхідні поживні середовища. Потім провели видову ідентифікацію мікроорганізмів і визначення їх чутливості до антибіотиків.

Негативний результат дослідження видавали через 72 години при умові відсутності росту на всіх поживних середовищах[5].

Бактеріологічне дослідження на наявність стафілококів.

При появі на ЖСА колоній, підозрілих на стафілококові обов’язково проводили мікроскопію та ідентифікацію цих колоній.

З жовтково-сольового агару знімали в першу чергу колонії стафілококів, які утворювали райдужний вінчик навколо колоній (позитивна лецитовітелазна реакція). Вивченню підлягали також пігментовані колонії та з негативною лецитовітелазною реакцією не менше двох колоній різного виду. Підозрілі колонії пересівали на чашки з кров’яним агаром. Подальше вивчення проходило згідно схеми[38].

Бактеріологічне дослідження на стафілокок.

1 –й день

Здійснювали посів на елективні середовища (жовтково-сольовий , молочно-сольовий або молочно-жовтково-сольовий агар). Засіяні середовища витримували в термостаті при 37⁰С впродовж 2 діб, чи одну добу в термостаті та додатково 24 години на світлі при кімнатній температурі.

2-3-й день

Переглядали чашки, фіксували в журналі характер та масивність росту. На вищевказаних середовищах стафілокок давав ріст у вигляді круглих блискучих, маслянистих, опуклих пігментованих колоній. Відсівали на скошений агар для подальшого дослідження не менше 2 колоній, підозрілих на стафілококові. Для дослідження відсівали перш за все колонії, які давали позитивну лецитовітелазну реакцію. Пробірки з посівом поміщали до термостату при 37⁰С на 18-24 години[38].

4-й день

Після добової інкубації у виділених штамів перевіряли морфологію, тинкторіальні властивості (забарвлення за Грамом), наявність плазмокоагулюючої активності та пластівцеутворюючого фактору. Під мікроскопом забарвлені за Грамом стафілококи мали вид фіолетово-синіх коків, які розташовувались гронами та невеликими купками («мереживо»)[18]. Плазмокоагудюючу активність перевіряли в реакції коагуляції плазми .

Якщо культура мала тільки плазмокоагулюючу або тільки лецитовітелазну активність, то для заключної відповіді потрібно було провести визначення ферментації маніту в аеробних умовах. Визначення антибіотикограми проводили тільки після виділення чистої культури.

5-й день

Проводили облік результатів визначення чутливості до антибіотиків та ферментації маніту в аеробних умовах. Здійснили заключну видачу відповіді[38].

Бактеріологічне дослідження на наявність грамнегативної мікрофлори.

Для визначення наявності ентеробактерій робили посіви на кров’яний агар та середовище Ендо. Якщо на них з’являвся характерний ріст для грамнегативних паличок, то подальшу ідентифікацію проводили згідно з наказом[38,14].

На середовищі Ендо були виявлені випуклі колонії з правильними краями , слизові, рожевого кольру з металевим блиском. Всі ці ознаки вказували на наявність у досліджуємому матеріалі представників родини Enterbacteriaceae. На деяких чашках було виявлено вуалеподібний ріст (роїння), що могло вказувати на наявність в досліджуємому матеріалі P.vulgaris або P.mirabilis. Для подальшого дослідження були відібрані підозрілі колонії, котрі були зняті бактеріальною петлею і посіяні штрихом по косяку і уколом в ствпчик на комбіноване середовище Олькеніцького. Це дало змогу після 18-20 годин інкубації при 37⁰С скласти попереднє заключення про можливу родову належність і визначитись з набором подальших необхідних тестів для ідентифікації. При закінченні часу інкубації на середовищі Олькеніцького був виявлений вологий, однорідний ріст. Було зроблено мікроскопію пофарбованих за Грамом мазків. Характерний ріст на комбінованому середовищі дозволив відразу визначити 4-5 ознак досліджуємої культури. Ці ознаки надали змогу визначитись з додатковими тестами і мінімальним диференцируючим рядом для визначення роду та виду наявного збудника в досліджуємому матеріалі[38,5].

Бактеріологічне дослідження на наявність грибів.

При виявленні росту на середовищі Сабуро було зроблено мазки та пофарбовано їх за Грамом.

На середовищі Сабуро колонії мали білувато-кремовий колір, були блискучими.

Для ідентифікації грибів було зроблено посіви на середовища з вуглеводами та проведено ідентифікацію.