Использование жевательных композиций для выявления аллельных полиморфизмов генома и днк-вирусов человека

Н. В. Осипов

Сибирский федеральный университет, г. Красноярск

Красноярский филиал «Гематологический научный центр» Минздрава России

В настоящее время молекулярно-генетические приобретают все большее значение в диагностики заболеваний человека. В связи с этим растет потребность в более надежном, эффективном и неинвазивном методе получения проб биологического материала для дальнейшего анализа нуклеиновых кислот.

Процедура венепункции достаточно болезненна для пациента и сопряжена с определенным риском. Взятие буккального эпителия также является методом, сопряженным с возможностью ранения слизистой ротовой полости и не всегда оптимальны с эстетической точки зрения. В качестве альтернативного неинвазивного метода взятия и накопления биологического материала нами предлагаются жевательные композиции на натуральной и синтетической основе. Более длительный контакт с клетками слизистой и высокий сорбционной потенциал позволяют надеяться на более эффективное выделение генетического материала как человека, так и присутствующих в ротовой полости вирусов. Кроме этого, использование жевательных композиций для выделения ДНК более удобно применять как неинвазивный метод при обследовании детей.

Целью данной работы является проверка возможности использования жевательных композиций для выявления генетических полиморфизмов и ДНК-содержащих вирусов.

Для обследования были отобраны добровольцы, имеющие по результатам ПЦР-РВ тестирования носителями полиморфизма в гене метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) в гетеро- и гомозиготной форме. После использования добровольцами жевательных композиций композиции проводилось выделение ДНК. При этом композиции на натуральной основе растворялась в этаноле и подвергалась воздействию детергента, после чего в смесь добавлялась силика – специальный сорбент для нуклеиновых кислот. После серии отмывок и высушивания, с сорбента физико-химическим способом элюировались молекулы ДНК, которые далее использовались для анализа на наличие или отсутствие полиморфизма с помощью таких технологий как ПЦР с гель-электрофоретической детекцией (НПФ Литех), ПЦР в режиме 198

«реального времени» (НПФ Литех) и метод пиросеквинирования. Для выделения нуклеиновых кислот из композиции на синтетической основе применялся коммерческий набор (Сорб-В, ЦНИИ Эпидемиологии) для выделения ДНК с модифицированным протоколом, имеющим практически все вышеперечисленные этапы выделения с той разницей, что предварительное растворение композиции проводилось непосредственно в растворе детергента, что ускорило процесс выделения.

Измерение концентрации выделенной ДНК на приборе Qubit продемонстрировало оптимум значений концентрации ДНК на 10-ой минуте использования композиции и было более выражено, если использовалось натуральная основа.

По результатам проведенных исследований было выявлено полное совпадение результатов генотипирования по гену МТГФР всех 14 человек, кровь которых ранее тестировалась на данный полиморфизм.

Для проведения исследований по обнаружению ДНК-содержащих вирусов были отобраны четыре добровольца с выявленным ранее гепатитом В. На момент проведения исследования все обследуемые имели положительные серологические маркеры гепатита и определенную методом ПЦР-РВ вирусную нагрузку (табл. 1).

Таблица 1. Характеристика пациентов №	Наличие HBSAg в крови	Вирусная нагрузка, копий/мл	Наличие вируса (ПЦР-РВ) в крови	Наличие (ПЦР-РВ) в композициях
1	+	2,65*10^5	+	+
2	+	1,34*10^3	+	+
3	+	2,36*10^6	+	+
4	-	<150	-	-

В дальнейшем из каждой композиции (как на натуральной, так и на синтетической основе) полученной от добровольца проводилось выделение ДНК по соответствующему протоколу. В результате проведенного исследование наличие вируса гепатита В в жевательных композициях было подтверждено у трех из четверых обследуемых. Отрицательный результат соответствовал пациенту с уровнем вирусной нагрузки в крови менее 150 копий/мл. Таким образом, использование жевательных композиции как на синтетической, так и на натуральной основе может быть полезным методом накопления биологического материала для выявления аллельных полиморфизмов генома и ДНК-содержащих вирусов.

Научные руководители – канд. биол. наук, доцент Т. Н. Субботина, канд. мед. наук И. А. Ольховский.