5.3. Підготовка пластинки для тшх
Пластину для ТШХ кладуть на стіл і простим олівцем легко, без натиску, на уявній, перпендикулярній до краю пластинки лінії старту, намічають 4 точки, однаково віддалені один від одного і від країв пластини. Бажано, щоб відстань між точками було не менше 1,5 см.
5.4. Нанесення проб на пластину
У намічені точки капіляром наносять приготовлені розчини в наступному порядку: у першу, другу і третю точки наносять стандартні розчини амінокислот (свідки), у четверту точку наносять суміш амінокислот. Нанесення проб проводять легким дотиком капіляра до точки на пластині. Діаметр плями повинен бути від 0,5 до 0,6 см. Коли всі 4 проби будуть нанесені, а плями висохнуть – пластина готова для проведення хроматографування.
5.5. Проведення хроматографування
Пластину з нанесеними пробами поміщають в хімічну склянку так, щоб лінія старту з нанесеними плямами була вище рівня елюента. Склянку закривають чашкою Петрі і чекають, коли елюент підніметься на 2/3 висоти пластини. Хроматограму виймають з камери, зазначивши олівцем висоту підйому фронту елюента, і сушать на повітрі.
5.6. Проявлення хроматограми
Для проявлення зон компонентів хроматограму обробляють реагентом за допомогою пульверизатора. Детектуючим реагентом для визначених речовин є 0,5%-вий розчин нінгідрину в ацетоні. Утворення забарвлено речовини при взаємодії α-амінокислот з нінгідрином описується рівняннями:
забарвлена форма
Утворена сполука завдяки наявності спряжених подвійних зв’язків забарвлена в інтенсивний колір. Після обробки пластину сушать впродовж 5 хвилин в термостаті при температурі 100-105 ºС. Зони аналізованих речовин і домішок проявляються у вигляді кольорових плям.
5.7. Якісний аналіз хроматограм
Проводять якісний аналіз хроматограм, тобто ідентифікують амінокислоти за величиною Rf. Відносну рухливість Rf всіх проявлених зон на хроматограмі розраховують за формулою
як відношення висоти підйому зони компонента l (відстань від лінії старту до центру плями) до висоти підйому фронту елюента L (відстань від лінії старту до лінії фронту) (рис. 1).
5.8. Результати експерименту
Результати експерименту оформлюють у вигляді таблиці.
Визначення амінокислотного складу суміші
Амінокислоти |
l, см |
L, см |
Rf |
Наявність компонентів (+/-) |
|||
інд. комп. |
суміш |
інд. комп. |
суміш |
інд. комп. |
суміш |
|
|
Амінокислота 1 |
|
- |
|
- |
|
- |
|
Амінокислота 2 |
|
- |
|
- |
|
- |
|
Амінокислота 3 |
|
- |
|
- |
|
|
|
Компонент 1 |
- |
|
- |
|
- |
|
|
Компонент 2 |
- |
|
- |
|
- |
|
|
Компонент 3 |
- |
|
- |
|
- |
|
|
На основі отриманих даних роблять висновок про склад досліджуваної суміші.