1.2 Подходы для выявления аллельного полиморфизма

Важной характеристикой генетических маркеров является полиморфизм. Генетический полиморфизм – это изменения в нуклеотидной последовательности ДНК маркера, обусловленные различными типами мутаций. Формы проявления генетического полиморфизма получили название аллелей. Наличие двух или более аллелей является необходимой предпосылкой для использования локуса в качестве возможного генетического маркера.

Впервые полиморфизм ДНК был тестирован и использован как генетический маркер в 1974 году при идентификации термочувствительной мутации в геноме аденовируса [Grodzicker et al., 1974].

Изобретение Кэрри Мюллисом в 1983 одного из основного метода синтеза заданных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов (ПЦР – полимеразная цепная реакция, или PCR – Polymerase Chain Reaction) облегчило и ускорило поиск и идентификацию ДНК-маркеров.

В настоящее время можно выделить два типа маркеров:

• мультилокусные ДНК-маркеры

Идентифицируются на основе ПЦР с праймерами имеющими множественную локализацию в геноме и позволяющие оценивать геномный полиморфизм в целом

• монолокусные ДНК-маркеры

Позволяют оценивать полиморфизм отдельных генов. В этой группе можно выделить ДНК-маркеры, созданные на основе типирования точковых мутаций, микроделеций или микроинсерций, и ДНК-маркеры основанные на анализе микросателлитов [Сулимова Г.Е., 2006].

К наиболее широко распространенным монолокусным ДНК-маркерам относятся маркеры, основанные на тестировании однонуклеотидных замен (SNP) B микросателлиты.

SNP (single nucleotide polymorphisms) - это однонуклеотидные позиции в геномной ДНК, для которых имеются различные варианты последовательностей (аллели), причём редкий аллель встречается с частотой не менее 1% [Brookes, 1999].

Возможно существование двух-, трёх- и четырёхаллельных полиморфизмов. Однако на практике чрезвычайно редки даже трёхаллельные SNP (менее 0.1% всех SNP человека [Lai 2001].

Для SNP характерна высокая плотность в геноме. Так, например, в геноме человека однонуклеотидные замены в среднем встречаются через каждые 30 т.п.о. [Lai 2001]. Такая плотность при систематическом анализе способна выявлять проявление полигенных признаков. Помимо высокой плотности, SNPs имеют очень низкий уровень мутаций на поколение (~10^-8), что делает их удобными маркерами молекулярной эволюции [Crow 1995; Li et al. 1996].

Стандартным методом анализа полиморфизма генов является ПЦР анализ с последующим рестрикционным гидролизом образующихся фрагментов (ПЦР-ПДРФ – полимеразная цепная цепная реакция – полиморфизм дли рестрикционных фрагмениов, или PCR-RFLP – polymerase chain reaction – restriction fragment polymorphism) [Shumm et al. 1988; Saperstin et al., 1991]. Суть метода заключается в амплификации определенного фрагмента ДНК, содержащего анализируемую точечную мутацию (SNP – однонуклеотидные замены в геномной ДНК), с последующим расщеплением его соответствующей рестрикционной эндонуклеазой. По длине фрагментов после расщепления делают вывод об отсутствии или наличие точечной мутации, а также о гомозиготности или гетерозиготности по данному аллелю.

Ограничением метода ПЦР-ПДРФ является то, что с его помощью можно тестировать только известные мутации, затрагивающие сайты рестрикции [Сулимова Г.Е., 2006].

Частично эти ограничения можно обойти, поменяв местами этапы амплификации и рестрикции (AFLP - amplification fragment length polymorphism).

Расщепление ДНК структуро-специфическими эндонуклеазами

Этот метод основан на расщеплении ренатурированных дуплексов ДНК конформационно-специфическими эндонуклеазами. Это приводит к появлению набора меченых фрагментов, которые разделяются в гель- или капиллярном электрофорезе [Sander et al. 1999]. Использованием Cleavase I, узнающей и расщепляющей несовершенные шпильки, удалось детектировать ряд мутаций в гене ТР53 [Okamoto and Nagano 1999]. Резольваза (эндонуклеаза VII) используется для энзиматической детекции мисматчей [Tito et al. 1998].

Лигазная детекция

В реакции лигазной детекции (LDR, Ligase detection Reaction) используются три олигонуклеотида, два из которых аллель-специфические и флуресцентно меченые (различаются только меткой и 3'-нуклеотидом, соответствующим позиции SNP), а третий располагается с 5' стороны от SNP и непосредственно примыкает к аллель-специфическому праймеру термостойкая лигаза. Полученные лигированные фрагменты детектируются с помощью электрофореза.

В другом варианте лигазной реакции (LCR, ligase chain reaction) за счет использования олигонуклеотидов, компелементарных обеим цепям, при каждый цикле лигирования происходит двукратное увеличением количества матрицы.

Аллель-специфичная ПЦР

С помощью Аллель-специфичной ПЦР аллельные полиморфизм выявляется за счёт того, что 3' концевой нуклеотид одного из праймеров гибридизуется непосредственно с позицией SNP [Kwok et al. 1990]. Специфичность реакции можно повысить вводя дополнительный, не спаренный нуклеотид во второй или третей позиции с 3' конца этого же праймера. Ещё один способ повышения специфичности - проведение в той же пробирке конкурирующей ПЦР реакции [Zhu et al. 1996; Sasvari-Szekely et al. 2000]. В настоящее время становится популярной аллель-специфичная амплификация с детекцией результатов амплификации в реальном времени (allele-specific real-time PCR, RT-ARMS PCR). Преимуществом этой модификации метода является отсутствие этапа электрофореза и снижение вероятности контаминации, а также уменьшение времени анализа.

Полиморфизм конформации одноцепочечной ДНК

В основе этого метода лежит разделение денатурированных продуктов ПЦР в денатурирующем геле. При этом дифференциация одноцепочечных фрагментов происходит в зависимости от их нуклеотидной последовательности, определяющей характер вторичных и третичных структур, и меняется даже при отличии в один нуклеотид.

Анализ гетеродуплексов

При использовании этого метода на различия в подвижности при электрофорезе достигаются за счет образования дуплексов и гетеродуплексов при ренатурации продуктов ПЦР (анализируемых и тестерных).

Дискриминация аллельных вариантов на твёрдой фазе

В этой методике используется твердый носитель небольшого размера (микроматрица) с прикрепленными к нему в определенном порядке короткими олигонуклеотидами (8-80нп) или фрагментами ДНК (размером более 100нп). Иммобилизованные фрагменты гибридизуются с неизвестной последовательностью, и тогда степень гибридизации служит сигналом наличия или отсутствия мутации, либо присутствующая в растворе ДНК может являться матрицей для синтеза ДНК с иммобилизованного праймера для определения прилежащего к нему нуклеотида.

Масс-спектрометрическое секвенирование

Это метод очень чувствителен, достоверно детектирует гомо- и гетерозиготы и позволяет оценить долю SNP при анализе нескольких образцов одновременно. При анализе ионизированные фрагменты ДНК разгоняются в электрическом поле и направляются через вакуумную камеру к детектору. Время движения обратно пропорционально скорости молекулы, которая, в свою очередь прямо пропорциональна отношению массы летящей молекулы к ее заряду. Эти параметры (отношение массы к заряду) - уникальны для каждой молекулы и определяются исключительно ее нуклеотидной последовательностью.

Микросателлиты — тандемно-повторяющиеся участки ядерной ДНК и ДНК органелл (митохондрий и пластид), состоящие из повторяющихся последовательностей нуклеотидов длиной от 1 до 6 пар оснований. Общий размер повторяющейся последовательности обычно не превышает 100 н.п.

Микросателлиты – первые полученные с использованием ПЦР, высокополиморфные маркеры для индивидуальных локусов. Эти маркеры известны под названиями: микросателлиты, STMS (Sequence Tagged Microsattelite Site), STR (short tandem repeat), SSR (simple sequence repeat) [Сулимова Г.Е., 2006].

Микросателлиты характеризуются высокой скоростью изменения последовательностей, обусловленной «проскальзыванием» при репликации ДНК и точечными мутациями.

На данный момент выделено и описано более 2000 микросателлитов в геноме крупного рогатого скота (база данных INRA, Франция) и их количество постоянно увеличивается. Микросателлиты имеют ряд преимуществ перед другими маркирующими системами: они множественны, высокополиморфны, широко распространены по всем хромосомам, легко выявляются и идентифицируются. С открытием микросателлитов появилась возможность достоверно определять происхождение животных, осуществлять маркировку некоторых генетических локусов, связанных с продуктивностью, характеризовать генетическую структуры популяций и степень инбредности, оценивать генетические расстояния между семействами, линиями, породами и видами животных, строить филогенетические ряды [Machugh D.E. et al, 1998; Peelman L.J. et al., 1998; Slate J. et al., 1998; George М. et al., 1993; Ron М. et al.,1994; Georges M. et al, 1995; Ohba Y. et al.,1999; Heyen D. W. et al., 1997; Kato Y. et al, 1998].

Отечественные породы КРС практически не идентифицированы по микросателлитным локусам [Сулимова Г.Е., 2006]. В имеющихся работах отмечается малоинформативность некоторых микросателлитных маркеров для пород крупного рогатого скота. Так в работах Удиной и др., 2001 и Хатами и др., 2005 при микросателлитном анализе 5’-нетранслируемой области гена пролактина у четырех пород КРС на территории России: красная горбатовская, ярославская, айрширская и черно-пестрая было выявлено только два аллеля и уровень гетерозиготности составлял от 3 до 24% [Удиной и др., 2001; Хатами и др., 2005]

В настоящее время разработаны чрезвычайно эффективные методы анализа микросателлитов. Diehl предложил использовать праймеры, меченые флуоресцентной краской, для PCR анализа динуклеотидных повторов с последующей детекцией продуктов реакции с помощью автоматического лазерного детектора фрагментов ДНК [Diehl S.R. e. a., 1990].

Ziegle с соавторами разработали автоматизированный метод анализа тандемных повторов с помощью стандартных автоматических секвенаторов ДНК [Ziegle J.S. e. a., 1992].

Методы идентификации мультилокусных ДНК-маркеров

Информативными методами, позволяющими выявлять полиморфизм на уровне мультилокусных ДНК-маркеров являются: RAPD-PCR, ISSR-PCR и AFLP.

RAPD-PCR

В основе RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic DNA - Polymerase Chain Reaction) лежит использование праймеров с произвольной случайной последовательностью. В настоящее время этот метод используется для решения теоретических и практических задач фундаментальной и частной генетики в изучении генома – конструирование генетических карт, анализ генетической структуры популяций, генотипирование, маркирование признаков [Харченко П.Н., Глазко В.И., 2006].

Несмотря на распространенность RAPD-анализа, это метод не лишен недостатков. Известно, что количество ДНК, используемое для анализа, существенно влияет на результат ПЦР. Концентрация ионов магния также влияет на количество и интенсивность продуктов амплификации. Кроме того, праймеры, используемые в RAPD, являются "случайной" затравкой. Это означает, что различные участки генома могут быть в большей или меньшей степени гомологичны последовательности праймера. Таким образом, незначительные изменения условий реакции может повлиять на ход реакции и ее продукт.

RAPD-анализ используется для исследования генетического разнообразия пород крупного рогатого скота и установление их родственных связей [Глазко и др., 1999]. Этот метод позволяет решать задачи по выяснению генетического разнообразия, для решения спорных вопросов систематики и филогении различных таксономических групп животных [Сулимова Г.Е. 2006].

Зубец М.В. с соавторами выявили 116 полиморфных локусов с помощью RAPD-анализа трех пород КРС (украинская красно-пестрая молочная, голштинская и симментальская). На основании значений RAPD-локусов и алгоритма Нея и Ли составили суммарную схему, отражающую генетические взаимоотношения между анализируемыми породами [Зубец М.В. и др., 2001].

ISSR-PCR

Для проведения ISSR-PCR (Inter-Simple Sequence Repeat - Polymerase Chain Reaction) необходимо использование праймеров, комплементарных микросателлитным повторам и несущих на одном из концов последовательность из одного-двух произвольных нуклеотидов. Такие праймеры позволяют амплифицировать фрагменты ДНК, находящиеся между двумя близко расположенными микросателлитами. Это метод не требует предварительной расшифровки нуклеотидной последовательности исследуемой ДНК.

В 2010 году В.И. Глазко с соавторами выполнили сравнительный анализ спектров фрагментов ДНК, фланкированных декануклеотидами и микросателлитными локусами у зубров, бизонов и ряда пород крупного рогатого скота. Полученные ими данные по генетическому полиморфизму с использованием ISSR-маркера (AG)9C, достаточно точно отражают как селекционную историю, так и современное состояние исследуемых пород. Им также удалось выявить локусы, консервативные у всех пород, вариабельные участки и сочетания фрагментов ДНК, присутствие которых имеет породоспецифичные особенности [В.И. Глазко и др., 2010].

В лаборатории сравнительной генетики животных ИОГен РАН проводятся с помощью ISSR-анализа проводятся исследования отечественных и зарубежных пород крупного рогатого скота. По ряду подобранных ISSR-праймеров охарактеризованы ярославская, бестужевская и калмыцкая породы КРС. НА примере двух выборок ярославского скота, полученных из разных хозяйств с помощью AG- ISSR и GA- ISSR раймеров показан пример внутривидового полиморфизма и высокая разрешающая способность этого метода [Сулимова Г.Е., 2006].

AFLP (amplification fragment length polymorphism, или полиморфизм длин продуктов рестрикции) включает три этапа:

1. рестрикцию ДНК и лигирование со специфическими олигонуклеотидными адаптерами;

2. избирательную амплификацию наборов рестрикционных фрагментов со специально сконструированными праймерами;

3. гель-электрофорез

Праймеры подбираются таким образом, чтобы они содержали последовательность компелементарную к адаптеру и сайту рестрикции и последовательность произвольно выбранных нуклеотидов [Vos et al. 1995].

AFLP-маркеры успешно используются в изучении филогенетических связей пород крупного рогатого скота и родственных видов, при анализе геномного полиморфизма крупного рогатого скота, в селекционных программах.

Отечественные порода крупного рогатого скота с использованием этого метода не исследованы [Сулимова Г.Е.].

REMAP (Retrotransposon-Microsatellite Amplified Polymorphism) – полимеразная цепная реакция с применением праймера к фрагменту LTR ретротранспозона и праймера к рядом расположенному к ретротраспозону простому микросателлитному повтору. К достоинствам метода относятся относительная простота и потенциально большое количество комбинаций при подборе праймеров к различным ретротранспозонам и микросптеллитам [Харченко П.Н., Глазко В.И., 2006]. Этот метод широко применяется для картирования генома и поиска маркеров у растений.