3.6. Исследование генетической структуры групп крупного рогатого скота по гену бета-лактоглобулина (βLg).

Идентификацию аллельного полиморфизма βLG по точечной замене в нуклеотидной последовательности в экзоне 4 предложил Medrano, et al. 1990 год. Эта мутация предполагает появление дополнительного сайта рестрикции для эндонуклеазы HaeIII и замене в пептидной последовательности аминокислоты Val на Ala для В варианта в положении 118.

Другая методика, определения аллелей А, В была разработана Гладырь [Гладырь и др.,2001]. По этой методике вариант В определяется по мутации второго основания триплета GAT>GGT во втором экзоне, приводящего к замене аминокислоты в положении 64.

По методике Medrano, et al., 1990 амплифицировали фрагмент ДНК включающий участок 4 интрона и 4 экзона 247 п.о. Вариант В от А отличается наличием дополнительного сайта для рестриктазы HaeIII. После обработки продуктов ПЦР этой рестриктазой появляются специфичные для этих аллелей фрагменты: 148 и 99п.о. – для А варианта и 99, 74 и74 п.о. для В варианта. На рисунке 3.6.1. показана электрофореграмма фрагментов ДНК после рестрикции эндонуклеазой HaeIII.

По методике (Гладырь и др., 2001) амплифицировали фрагмент длиной 1248 п.о. После рестрикции по сайтам PvuII наблюдали появление специфичных фрагментов длиной 774 и 474 п.о. соответствующих аллелю А. Точковая мутация в нуклеотидной последовательности варианта В обуславливает образование дополнительно сайта рестрикции PvuII и приводит к появлению трёх специфичных для аллеля В фрагментов длиной 774, 297 и 177 п.о. Фрагменты с длинами соответствующие аллелю D выявлены не были. Рестрикция PstI позволяет определять аллель С. В анализируемых образцах вариант C также обнаружен не был. Пример определения варианта гена бета-лактоглобулина по этой методике приведен на рисунке 3.6.2.

Выявление аллельных вариантов гена βLG мы проводили по двум выше представленным методикам, в основе которых лежит анализ точечных нуклеотидных замен в экзонах 2 и 4.

При анализе полиморфизма бета-лактоглобулина с разной частотой были выявлены три генотипа. Результаты анализа генетической структуры изучаемых групп КРС и частоты несовпадений в определении генотипов по описанным методикам указаны в таблице 3.6.1. При оценке полиморфизма гена бета-лактоглобулина в исследуемых группах КРС в разной степени наблюдается преобладание В-аллеля, максимальная частота этого аллеля зафиксирована в группе коров айрширской породы, там она достигает 77%. В этой же группе отмечена наивысшая частота АА-генотипа. Иная картина наблюдается в группах коров черно-пестрой породы и частного скота. В этих группах чаше всего встречались животные с гетерозиготным генотипом. В выборке частного скота отмечены приближенные значения частот А – и В – генотипов. Наглядно соотношение частот генотипов гена β – лактоглобулина в исследуемых группах КРС представлено на рисунке 3.6.3.

Во всех анализируемых группах крупного рогатого скота выявленные частоты аллелей достоверно не отклонятся от теоретически рассчитанных.

Рис. 3.6.1 - Электрофоретический анализ продуктов рестрикции, при определении генотипа β – лактоглобулина по методике Medrano, et al., 1990. 1 – маркер молекулярных масс М27 (СибЭнзим); Генотипы образцов 2-6 указаны на фотографии

Рис 3.6.2 - Электрофоретический анализ продуктов рестрикции, при определении генотипа β – лактоглобулина по методике Гладырь и др., 2001. 1 – маркер молекулярных масс М27 (СибЭнзим); Генотипы образцов 2-7 указаны на фотографии

Таблица 3.6.1

Генетическая структура анализируемых групп КРС по гену бета-лактоглобулина определенная по методикам Гладырь и др., 2001 и Medrano, et al., 1900

порода	n	Частота аллелей и генотипов, % по методике Гладырь и др.,2001									Частота аллелей и генотипов, % по методике Medrano, et al., 1900					Частота несовпадений генотипов, %
		АA	AВ		ВB		А			В	АA	AВ	ВВ	А	В
Черно-пестрая	55	19,4	50		30,5		0,41		0,58		19,4	47,2	33,3	0,43	0,57	2,7
Hex	0,493										0,49
Hobs	0,5										0,472
χ2	0,0043
Айрширская	50	6,6	31,3		62,2		0,22		0,77		2,2	26,6	71,1	0,15	0,84	13,3
Hex	0,345										0,262
Hobs	0,311										0,266
χ2	0,8445										-
Частный скот	146	21,3		52,4		26,2		0,47		0,52	18,0	42,6	39,3	0,39	0,6	9,7
Hex	0,498										0,477
Hobs	0,524										0,426
χ2	0,3963										-

Рис.3.6.3- Соотношение частот генотипов β-лактоглобулина в анализируемых группах КРС. 1 – группа коров черно-пестрой породы, ОАО «Снежка-Госома; 2 – частный скот (Жирятинский р-н, Брянской области); 3 – группа коров айрширской породы, СПХ Сельцо.

В таблице 3.6.2 приведены частоты А-аллеля β-лактоглобулина в группах крупного рогатого скота разных пород. Из таблицы видно, что преобладание В-аллеля наблюдается в разных регионах мира. Исключением являются некоторые группы коров голштинской и чешской красной. В этих группах частота А-аллеля превышает частоту В-аллеля. Кроме того, для разных групп крупного рогатого скота голштинской породы из разных регионов мира в литературе приводятся близкие значения частот аллелей. Так, например, в группе голштинов из США, Ирана, Мексики, Украины, Аргентины частоты А-аллеля составляют - 0,530, 0529, 0,470, 0460, 0,43 соответственно. Вероятно, что для голштинской породы частота аллелей гена бета-лактоглобулина может является породоспецифичной характеристикой. Ранее, Глазко ранее отмечал у голштинов по локусу каппа-казеина незначительные межгрупповые различия, не зависящие от региона разведения [Глазко, 2006].

Частота А-аллеля в исследуемых нами группах частного скота и коров черно-пестрой породы приближенно соответствует частотам этого аллеля в разных группах КРС голштинской породы, что косвенно может быть связано с голштинизацией.

Таблица 3.6.2

Частота А-аллеля бета-лактоглобулина в группах КРС Брянской области и в других регионах

порода	Частота А-аллеля	Автор	Регион
Чешская красная	0,571	M Zatoń-Dobrowolskaet al., 2006	Польша
Caracu	0,57	Kemenes et al.1999	Бразилия
Голштинская	0,530	A. Barreras et al., 2001	США
Голштинская	0,529	Heidari et al.	Иран
Якутская	0,516	Гладырь и др., 2000	Россия
Черно-пестрая	0,48	Гладырь и др., 2000	Россия
Частный скот	0,47	Собственные данные	Россия, Брянск
Голштинская	0,470	А. Barreras et al., 2002	Мексика
Голштинская	0,460	Копылова К.В., и др., 2009	Украина
Romanian Spotted	0,450	Ilie D et al., 2008	Румыния
Голштинская	0,43	A. G. Bonvillani et al., 1998	Аргентина
Черно-пестрая	0,41	Собственные данные	Россия, Брянск
Швицкая	0,406	Гладырь и др., 2000	Россия
Nelore (Bos indicus)	0,40	Kemenes et al.1999	Бразилия
Польская красная	0,397	M Zatoń-Dobrowolskaet al., 2006	Польша
Tharparkar(Bos indicus)	0,39	S. Rachagani et al., 2006	Индия
Gyr	0,37	Kemenes et al.1999	Бразилия
Brown of Maramures	0,333	Ilie D et al., 2008	Румыния
Эстонская голштинская	0,319	Sirje Varv, et al., 2009	Эстония
Bubalus bubalis	0,301	Rajesh K et al., 2007	Индия
Jersey × Zebu,	0,30	Rajesh K. PATEL et al., 2007	Индия
Украинская черно-пестрая	0,278	Малиенко В.А., и др., 2008	Украина
Голштино-фризская × Zebu	0,26	Rajesh K. PATEL et al., 2007	Индия
Красная горбатовская	0,246	Гладырь и др., 2000	Россия
Айрширская	0,22	Собственные данные	Россия, Брянск
Hanwoo	0,208	Kim, J et al., 1998	Корея
Германская красная	0,191	M Zatoń-Dobrowolskaet al., 2006	Польша
Эстонская	0,188	Sirje Varv, et al., 2009	Эстония
Sahiwal (Bos indicus)	0,17	S. Rachagani et al., 2006	Индия
Украинская черно-пестрая	0,165	Копылова К.В., и др., 2009	Украина
Корейская	0,153	Chung, E. R et al., 1998	Корея
Эстонская красная	0,138	Sirje Varv, et al., 2009	Эстония
Датская красная	0,110	M Zatoń-Dobrowolskaet al., 2006	Польша
Абердин-ангусская	0,2	Копылова К.В., и др., 2009	Украина