2.8. Анализ полиморфизма гена гипофизарного фактора транскрипции (pit-1)

Для выявления полиморфизма гена гипофизарного фактора транскрипции, с помощью праймеров:

1. PIT-1 /HinfI: 5^/- CAA-TGA-GAA-AGT-TGG-TGC-3^/

2. PIT-1 /HinfI: 5^/- TCT-GCA-TTC-GAG-ATG-CTC -3^/ [Moody, 1995] амплифицировали фрагмент ДНК длиной 1355 п.о.

ДНК денатурировали при 94°С в течение 4 минут далее проводили 35 циклов амплификации в следующем режиме: 94°С – 1минут, отжиг праймеров при 54°С - 1 минут элонгация при 72°С – 1минут Конечный этап синтеза проводили при 72°С в течение 4 минут.

Для определения полиморфизма гена соматотропина 3 мкл ПЦР смеси обрабатывали 5 ед. эндонуклы рестрикции HinfI в 1×буфере «O» фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 ⁰С течение 1 часа.

Появление фрагментов – 660 н.п., 425 н.п. и 270 н.п. после обработки продуктов ПЦР рестриктазой соответствует (А) - аллелю гена; фрагменты - 660 н.п., 385 н.п. и 270 н.п. указывает на (В)-вариант.

Для визуализации фрагментов ДНК проводили горизонтальный электрофорез при 10 В/см в 1×ТВЕ буфере на 1,0 % агарозной пластине содержащей 0,1 мкг/мл этидия бромида.

2.9. Статистическая обработка результатов

Частоту встречаемости генотипов определяли по формуле:

р = n/N, где р – частота генотипа, n – количество особей,

имеющих определенный генотип, N – число особей.

Частоту отдельных аллелей определяли по формуле:

Р_А = (2nAA+nAB) : 2N и q_B = (2nBB+nAB) : 2N, где P_А – частота аллеля А, q_B – частота аллеля В, N – общее число аллелей.

Для оценки достоверности отклонения распределения выявленных частот аллелей от теоретически ожидаемого использовали критерий хи-кадрат.

Статистическую обработку проводили с помощью программ «Statistika 6.0.», «Popgene 1.31.», MS Excel 2003 (Microsoft) и «Pop Stat», разработанной Гусаревой Е. и В.Рюхко, 2001.

3. Результаты и обсуждение

3.1. Генетическая структура исследуемых групп крупного рогатого скота по гену каппа-казеина (csn3)

Нами определены генотипы по гену каппа-казеину 55 коров и 16 телят черно-пёстрой породы ОАО "Снежка-Госома", аирширской породы (n=50) СПХ Сельцо и 146 частных коров на территории Жирятинского района Брянской области.

Аллельные варианты А и В белка каппа-казеина отличаются двумя аминокислотными заменами (Thr 136Iso и Asp 148Ala) и кодируются разными аллелями гена.

На рисунке 3.1.1. представлена электрофореграмма с примером определения варианта гена каппа-казеина с помощью рестриктазы HinfI.

Проведенный нами анализ показал отсутствие полиморфизма локуса каппа-казеина. Во всех анализируемых группах был отмечен только генотип АА.

В таблице 3.1.1. приведены частоты В-аллеля CSN3 в группах КРС разных пород. Из таблицы видно, что частоты аллелей каппа-казеина в разных стадах одной породы различны. Так, например, внутри самой распространенной черно-пестрой породы КРС частота В-аллеля колеблется от 0,34 (Краснодарский край) до полного отсутствия (Брянск) или внутри симментальской породы – 0,560 (Словакия) и 0,16 (Рязанская обл.). Эти данные указывают на то, что частота аллельных вариантов гена каппа-казеина не является породоспецифичной характеристикой. Вероятно, распределение частот аллелей этого гена, определяется особенностями воспроизводства стада, в процессе которого не учитывается генотип производителей.

Рис. 3.1.1 - Электрофоретический анализ продуктов рестрикции, при определении генотипа каппа-казеина; слева на право – 1-6 продукты ПЦР; 1-6 продукты рестрикции HinfI. Генотипы образцов указаны на фотографии.

Таблица 3.1.1

Частоты В-аллеля каппа-казеина в группах КРС Брянской области и других регионов.

Порода	Частота В-аллеля	Ссылка	Регион
Симментальская	0,560	D. Vasicek et al., 1995	Словакия
Ярославская	0,529	Журавель Е.В., 1999	Россия
Серая украинская	0,500	Журавель Е.В., 1999	-
Бурая карпатская порода	0,50	Копылова К. В., 2006	Украина
Ярославская	0,475	Сулимова Г.Е. и др., 2007	Россия, Ярославская обл.
Симментальская	0,470	A. Felenczak et al.,2006	Польша
Ярославская	0,44	Хабибрахманова Я.А., 2009	Россия, Ярославская обл.
Красно-пестрая	0,436	Баршинова А.В., и др., 2004	Россия, Липецкая обл.
Голштинская	0,410	Усенбеков Е.С.,1995	Россия, Ленинградская обл.
Черная уэльская	0,397	Журавель Е.В., 1999	Англия
Красная польская	0,380	Копылова К. В., 2006	Украина
Черно-пестрая	0,380	Усенбеков Е.С.,1995	Россия, Ленинградская обл.
Бурая карпатская	0,364	Журавель Е.В., 1999	-
Аргентинская голштинская	0,353	C.D. Golijow et al.,1999	Аргентина
Аргентинская креольская	0,344	C.D. Golijow et al.,1999	Аргентина
Черно-пестрая	0,34	Денисенко Е.А., 2004	Россия, Краснодарский край
Красно-пестрая	0,33	Юхманова Н.А., 2004	Мордовия
Калмыцкая	0,324	Сулимова Г.Е. и др., 2007	Калмыкия
Бестужевская	0,293	Сулимова Г.Е. и др., 2007	Татарстан
Красно-пестрая	0,27	Алипамах М., 2006	Россия, Воронежская обл.
Якутская	0,253	Сулимова Г.Е. и др., 2007	Якутия
Симментальская	0,245	Коновалова Е.Н. и др., 2004	Россия, Орловская обл.
коровы татарского типа	0,17-0,27	Ахметов Т.М., 2009	Татарстан
Холмогорская	0,23	Глотова Г.Н., 2007	Россия, Рязанская обл.
Чёрно-пёстрая (голшт.)	0,22	Хабибрахманова Я.А., 2009	Россия, Московская обл.
Черно-пестрая	0,22	D. Vasicek et al., 1995	Словакия
Голштино-фризская	0,21	D. Vasicek et al., 1995	Словакия
Холмогорская (голшт.)	0,20	Хабибрахманова Я.А., 2009	Россия, Московская обл.
Черно-пестрая	0,170	Яцына О.А., 2010	Беларусь
Черно-пестрая	0,17	Алипамах М., 2006	Россия, Московская обл.
Симментальская (голшт.)	0,16	Хабибрахманова Я.А., 2009	Россия, Рязанская обл.
Черно-пестрая	0,153	Сулимова Г.Е. и др., 2007	Россия, Московская обл.
Абердин-ангусская	0,150	Арнаут Е.А., 2008	Украина
Украинская красно-пестрая	0,105	Арнаут Е.А., 2008	Украина
Украинская черно-пестрая	0,099	Малиенко В.А. и др., 2008	Украина
Черно-пестрая	0	Собственные данные	Россия, Брянск
Айрширская	0	Собственные данные	Россия, Брянск
Частный скот	0	Собственные данные	Россия, Брянск
Голштинская	0	Хаертдинов Р.А., и др., 1997	Татарстан