- •Введение
- •1. Литературный обзор
- •1.1. Молекуляно-генетический анализ количественных признаков.
- •1.2 Подходы для выявления аллельного полиморфизма
- •1.3. Характеристика генов основных белков молока.
- •1.3.1. Гены казеинов молока
- •1.3.2. Бета-лактоголобулин
- •1.4. Характеристика генов гормонов, влияющих на параметры молочной продуктивности
- •1.4.1. Соматотропин (gh)
- •1.4.2. Пролактин (prl)
- •1.5. Гипофизарный фактор транскрипции (pit-1)
- •2. Методы и объекты исследования
- •2.1. Выделение днк из крови
- •2.2. Определение белка в молоке.
- •2.3. Анализ полиморфизма гена каппа-казеина (csn3)
- •2.4. Анализ полиморфизма гена бета-лактоглобулина.
- •2.4.1. Анализ полиморфизма гена бета-лактоглобулина (βLg) по методике Medrano, et al., 1990 .
- •2.4.2. Анализ полиморфизма гена бета-лактоглобулина (βLg) по методике Гладырь е.А., 2001.
- •2.5. Анализ полиморфизма гена соматотропина по MspI-маркеру (gh/MspI)
- •2.6. Анализ полиморфизма гена соматотропина по AluI-маркеру (gh/AluI)
- •2.7. Анализ полиморфизма гена пролактина (prl)
- •2.8. Анализ полиморфизма гена гипофизарного фактора транскрипции (pit-1)
- •2.9. Статистическая обработка результатов
- •3. Результаты и обсуждение
- •3.1. Генетическая структура исследуемых групп крупного рогатого скота по гену каппа-казеина (csn3)
- •3.2. Генетическая структура исследуемых групп крупного рогатого скота по гену пролактина (prl).
- •3.3. Генетическая структура исследуемых групп крупного рогатого скота по гену гипофизарного фактора транскрипции (pit-I).
- •3.4. Генетическая структура исследуемых групп крупного рогатого скота по гену соматотропина (gh).
- •3.4.1. Исследование генетической структуры групп крупного рогатого скота по MspI-маркеру гена соматотропина.
- •3.4.2. Исследование генетической структуры групп крупного рогатого скота по AluI-маркеру гена соматотропина.
- •3.5. Сравнение распространения аллелей гена соматотропина по MspI- и AluI – маркерам у крс в Брянской области и других регионах.
- •3.6. Исследование генетической структуры групп крупного рогатого скота по гену бета-лактоглобулина (βLg).
- •3.7. Анализ сочетания мутаций при определении а и в аллелей гена β-лактоглобулина.
- •3.8. Определение гетерозиготности в изучаемых группах крупного рогатого скота
- •3.9. Анализ состава комплексных генотипов в исследуемых группах крс
- •4.0. Анализ влияния аллельных вариантов исследуемых генов на показатели молочной продуктивности крс.
- •4.1.1. Изучение связи генотипов бета-лактоглобулина с параметрами молочной продуктивности крс.
- •4.1.2. Определение влияния аллельных вариантов гена соматотропина по MspI-маркеру на параметры молочной продуктивности крс.
- •4.1.3. Анализ связи аллельных вариантов гена соматотропина по AluI-маркеру с параметрами молочной продуктивности крс.
- •4.1.4. Комплексное влияние вариантов гена соматотропина по AluI- и MspI - маркерам на молочную продуктивность
- •4.1.5. Анализ связи аллельных вариантов гена гипофизарного фактора транскрипции (pit-1) с параметрами молочной продуктивности крс.
- •Практические рекомендации
- •Список литературы
2.5. Анализ полиморфизма гена соматотропина по MspI-маркеру (gh/MspI)
Для выявления полиморфизма гена соматотропина MspI-маркеру, с помощью праймеров:
GH/MspI: 5/- CCC-ACG-GGC-AAG-AAT-GAG-GC-3/
GH/MspI: 5/- TGA-GGA-ACT-GCA-GGG-GCC-CA -3/ [Mitra A., 1995] амплифицировали фрагмент ДНК длиной 329 п.о.
ДНК денатурировали при 94°С в течение 4 минут далее проводили 35 циклов амплификации в следующем режиме: 94°С – 1минут, отжиг праймеров при 62°С - 1 минут элонгация при 72°С – 1минут Конечный этап синтеза проводили при 72°С в течение 4 минут.
Для определения полиморфизма гена соматотропина 10 мкл ПЦР смеси обрабатывали 5 ед. эндонуклеазы рестрикции MspI в 1×буфере «B» фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 0С течение 1 часа.
Появление фрагментов – 224 н.п. и 105 н.п. после обработки продуктов ПЦР рестриктазой соответствует (+) - аллелю гена. Отсутствие расщепления указывает на (-)-вариант.
Для визуализации фрагментов ДНК проводили горизонтальный электрофорез при 10 В/см в 1×ТВЕ буфере на 1,0 % агарозной пластине содержащей 0,1 мкг/мл этидия бромида.
2.6. Анализ полиморфизма гена соматотропина по AluI-маркеру (gh/AluI)
Для выявления полиморфизма гена соматотропина AluI-маркеру, с помощью праймеров:
GH/AluI: 5/- GCT-GCT-CCT-GAG-GGC-CCT-TCG-3/
GH/AluI: 5/- GCG-GCG-GCA-CTT-CAT-GAC-CCT -3/ [Schlee, 1994] амплифицировали фрагмент ДНК длиной 223 п.о.
ДНК денатурировали при 94°С в течение 4 минут далее проводили 35 циклов амплификации в следующем режиме: 94°С – 1минут, отжиг праймеров при 59°С - 1 минут элонгация при 72°С – 1минут Конечный этап синтеза проводили при 72°С в течение 4 минут.
Для определения полиморфизма гена соматотропина 3 мкл ПЦР смеси обрабатывали 5 ед. эндонуклы рестрикции AluI в 1×буфере «Y» фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 0С в течение 5 часов.
Появление фрагментов – 171 н.п. и 52 н.п. после обработки продуктов ПЦР рестриктазой соответствует (L) - аллелю гена. Отсутствие расщепления указывает на (V)-вариант.
Для визуализации фрагментов ДНК проводили горизонтальный электрофорез при 10 В/см в 1×ТВЕ буфере на 1,0 % агарозной пластине содержащей 0,1 мкг/мл этидия бромида.
2.7. Анализ полиморфизма гена пролактина (prl)
Для выявления полиморфизма гена пролактина, с помощью праймеров:
PRL /RsaI: 5/- CGA-GTC-CTT-ATG-AGC-TTG-ATT-CTT-3/
PRL /RsaI: 5/- GCC-TTC-CAG-AAG-TCG-TTT-GTT-TTC -3/ [Mitra A., 1995] амплифицировали фрагмент ДНК длиной 156 п.о.
ДНК денатурировали при 94°С в течение 4 минут далее проводили 35 циклов амплификации в следующем режиме: 94°С – 1минут, отжиг праймеров при 59°С - 1 минут элонгация при 72°С – 1минут Конечный этап синтеза проводили при 72°С в течение 4 минут.
Для определения полиморфизма гена соматотропина 3 мкл ПЦР смеси обрабатывали 5 ед. эндонуклы рестрикции RsaI в 1×буфере «B» фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 0С течение 1 часа.
Появление фрагментов – 82 н.п. и 74 н.п. после обработки продуктов ПЦР рестриктазой соответствует (B) - аллелю гена. Отсутствие расщепления указывает на (A)-вариант.
Для визуализации фрагментов ДНК проводили горизонтальный электрофорез при 10 В/см в 1×ТВЕ буфере на 1,0 % агарозной пластине содержащей 0,1 мкг/мл этидия бромида.