- •Введение
- •1. Литературный обзор
- •1.1. Молекуляно-генетический анализ количественных признаков.
- •1.2 Подходы для выявления аллельного полиморфизма
- •1.3. Характеристика генов основных белков молока.
- •1.3.1. Гены казеинов молока
- •1.3.2. Бета-лактоголобулин
- •1.4. Характеристика генов гормонов, влияющих на параметры молочной продуктивности
- •1.4.1. Соматотропин (gh)
- •1.4.2. Пролактин (prl)
- •1.5. Гипофизарный фактор транскрипции (pit-1)
- •2. Методы и объекты исследования
- •2.1. Выделение днк из крови
- •2.2. Определение белка в молоке.
- •2.3. Анализ полиморфизма гена каппа-казеина (csn3)
- •2.4. Анализ полиморфизма гена бета-лактоглобулина.
- •2.4.1. Анализ полиморфизма гена бета-лактоглобулина (βLg) по методике Medrano, et al., 1990 .
- •2.4.2. Анализ полиморфизма гена бета-лактоглобулина (βLg) по методике Гладырь е.А., 2001.
- •2.5. Анализ полиморфизма гена соматотропина по MspI-маркеру (gh/MspI)
- •2.6. Анализ полиморфизма гена соматотропина по AluI-маркеру (gh/AluI)
- •2.7. Анализ полиморфизма гена пролактина (prl)
- •2.8. Анализ полиморфизма гена гипофизарного фактора транскрипции (pit-1)
- •2.9. Статистическая обработка результатов
- •3. Результаты и обсуждение
- •3.1. Генетическая структура исследуемых групп крупного рогатого скота по гену каппа-казеина (csn3)
- •3.2. Генетическая структура исследуемых групп крупного рогатого скота по гену пролактина (prl).
- •3.3. Генетическая структура исследуемых групп крупного рогатого скота по гену гипофизарного фактора транскрипции (pit-I).
- •3.4. Генетическая структура исследуемых групп крупного рогатого скота по гену соматотропина (gh).
- •3.4.1. Исследование генетической структуры групп крупного рогатого скота по MspI-маркеру гена соматотропина.
- •3.4.2. Исследование генетической структуры групп крупного рогатого скота по AluI-маркеру гена соматотропина.
- •3.5. Сравнение распространения аллелей гена соматотропина по MspI- и AluI – маркерам у крс в Брянской области и других регионах.
- •3.6. Исследование генетической структуры групп крупного рогатого скота по гену бета-лактоглобулина (βLg).
- •3.7. Анализ сочетания мутаций при определении а и в аллелей гена β-лактоглобулина.
- •3.8. Определение гетерозиготности в изучаемых группах крупного рогатого скота
- •3.9. Анализ состава комплексных генотипов в исследуемых группах крс
- •4.0. Анализ влияния аллельных вариантов исследуемых генов на показатели молочной продуктивности крс.
- •4.1.1. Изучение связи генотипов бета-лактоглобулина с параметрами молочной продуктивности крс.
- •4.1.2. Определение влияния аллельных вариантов гена соматотропина по MspI-маркеру на параметры молочной продуктивности крс.
- •4.1.3. Анализ связи аллельных вариантов гена соматотропина по AluI-маркеру с параметрами молочной продуктивности крс.
- •4.1.4. Комплексное влияние вариантов гена соматотропина по AluI- и MspI - маркерам на молочную продуктивность
- •4.1.5. Анализ связи аллельных вариантов гена гипофизарного фактора транскрипции (pit-1) с параметрами молочной продуктивности крс.
- •Практические рекомендации
- •Список литературы
2.3. Анализ полиморфизма гена каппа-казеина (csn3)
Для выявления полиморфизма гена каппа-казеина, с помощью праймеров:
SGE: 5/- TAT-CAT-TTA-TGG-CCA-TTG-GAC-CA-3/
SGO: 5/- CTT-CTT-TGA-TGT-CTC-CTT-AGA-GTT -3/ [Г.Е. Сулимова и др.,1991] амплифицировали фрагмент ДНК длиной 228 п.о.
ДНК денатурировали при 94°С в течение 4 минут далее проводили 35 циклов амплификации в следующем режиме: 94°С – 1минут, отжиг праймеров при 56°С - 1 минут элонгация при 72°С – 1минут Конечный этап синтеза проводили при 72°С в течение 4 минут.
Для определения полиморфизма гена каппа-казеина 10 мкл ПЦР смеси обрабатывали 5 ед. эндонуклы рестрикции HinfI в 1×буфере «O» фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 0С течение 1 часа.
Появление фрагментов – 135 н.п. и 93 н.п. после обработки продуктов ПЦР рестриктазой HinfI соответствует – А варианту гена. Отсутствие расщепления указывает на В-аллель.
Для визуализации фрагментов ДНК проводили вертикальный электрофорез при 15 В/см в 1×ТВЕ буфере на 3,0 % в полиакриламидной пластине. Пластину окрашивали раствором 1×ТВЕ содержащим 0,1 мкг/мл этидия бромида.
2.4. Анализ полиморфизма гена бета-лактоглобулина.
Выявление аллельных вариантов гена βLG проводили по двум выше представленным методикам, в основе которых лежит анализ точечных нуклеотидных замен в экзонах 2 и 4.
2.4.1. Анализ полиморфизма гена бета-лактоглобулина (βLg) по методике Medrano, et al., 1990 .
Для выявления полиморфизма гена бета-лактоглобулина, с помощью праймеров:
β-LG/HaeIII: 5/- TGT-GCT-GGA-CAC-CGA-CTA-CAA-AAA-G-3/
β-LG/HaeIII: 5/- GCT-CCC-GGT-ATA-TGA-CCA-CCC-TCT-3/ (J.F. Medrano and E. Aguilar-Cordova, 1990) амплифицировали фрагмент ДНК длиной 247 п.о.
ДНК денатурировали при 94°С в течение 4 минут далее проводили 35 циклов амплификации в следующем режиме: 94°С – 1минут, отжиг праймеров при 55°С - 1 минут элонгация при 72°С – 1минут Конечный этап синтеза проводили при 72°С в течение 4 минут.
Для определения полиморфизма гена бета-лактоглобулина 10 мкл ПЦР пробы обрабатывали 5 ед. эндонуклеазы рестрикции HaeIII в 1×буфере «G» фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 0С течение 3 часов.
После обработки продуктов ПЦР этой рестриктазой появляются аллельспецифичные фрагменты: 148 и 99п.о. – для А варианта и 99, 74 и74 п.о. для В варианта.
Для визуализации фрагментов ДНК проводили горизонтальный электрофорез при 10 В/см в 1×ТВЕ буфере на 3,0 % агарозной пластине содержащей 0,1 мкг/мл этидия бромида.
2.4.2. Анализ полиморфизма гена бета-лактоглобулина (βLg) по методике Гладырь е.А., 2001.
Для выявления полиморфизма гена бета-лактоглобулина, с помощью праймеров:
β-LG/PvuII :5/- CTA-TTG-TCC-TCG-TAG-AGG-AAG-C-3/
β-LG/PvuII :5/- AGA-AAG-CCC-TGG-ATA-AGC-AGC-C -3/ (Гладырь Е.А., 2001) амплифицировали фрагмент ДНК длиной 1248 п.о.
ДНК денатурировали при 94°С в течение 4 минут далее проводили 35 циклов амплификации в следующем режиме: 94°С – 1минут, отжиг праймеров при 60°С - 1 минут элонгация при 72°С – 1минут Конечный этап синтеза проводили при 72°С в течение 4 минут.
Для определения полиморфизма гена бета-лактоглобулина по 10 мкл ПЦР смеси обрабатывали по 5 ед. эндонуклеаз рестрикции PvuII и PstI в 1×буферах «G» и «O» соответственно фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 0С течение 2 часов.
После обработки продуктов ПЦР рестриктазой PvuII появляются аллельспецифичные фрагменты: 774 и 474 п.о. соответствуют А-аллелю и 774, 297 и 177 п.о. для В варианта. Рестрикция PstI позволяет определять аллель С по наличию фрагментов - 896, 177.
Для визуализации фрагментов ДНК проводили горизонтальный электрофорез при 10 В/см в 1×ТВЕ буфере на 1,0 % агарозной пластине содержащей 0,1 мкг/мл этидия бромида.