3.2.2. Метод внутрішньої нормалізації

Цей метод використовується за умови, коли всі компоненти аналізованої проби розділяються, потрапляють в детектор і дають там електричний сигнал. У методі сума площ всіх хроматографічних піків аналізованої суміші прирівнюється до 100% і за величинами площ окремих компонентів визначають їх відсотковий вміст у аналізованій суміші. Таким чином, цей метод дозволяє встановити лише відносний вміст компонентів в суміші.

Сума концентрацій всіх компонентів проби дорівнює 100 %. Для n-компонентної суміші можна записати:

.

З врахуванням рівняння , одержимо:

.

Концентрація і-того компоненту визначається за формулою:

.

Розділивши чисельник і знаменник дробу на калібрувальний коефіцієнт однієї з речовин, яку приймають за стандарт, одержимо:

.

Множники перед величиною піків окремих компонентів називаються нормувальними. Вони відображають різну чутливість детектора до цих речовин в порівнянні зі стандартом, тобто:

.

Нормувальний множник речовини, вибраної як стандарт, дорівнює 1.

Концентрацію будь-якого компонента аналізованої суміші визначають за формулою:

.

Нормувальні множники речовин відносно стандартної речовини знаходять експериментально, хроматографуючи штучні суміші з відомими концентраціями компонентів, за формулою:

Перевага методу внутрішньої нормалізації полягає у виключенні необхідності точного дозування проби. Недоліком методу є те, що всі компоненти суміші повинні розділятися, і для них всіх треба визначити нормувальні множники.

Порядок виконання аналізу. Для встановлення кількісного складу досліджуваної суміші готують з чистих індивідуальних речовин калібрувальну суміш. Для цього зважують на аналітичних вагах чисту і суху баночку з корком. По черзі вносять у неї визначену викладачем кількість індивідуальних речовин, зважуючи її після кожного додавання. Загальний об’єм суміші не повинен перевищувати 1 – 1,5 мл. Далі розраховують процентний вміст калібрувальної суміші і три рази вводять проби об’ємом 2-3 мкл у хроматограф, фіксуючи хроматограми.

Для розрахунку нормувальних множників (f) один з компонентів суміші за вказівкою викладача приймають як стандартний, для якого f=1. Для всіх інших компонентів нормувальні множники розраховують за формулою:

Кількісну характеристику хроматографічного піку Р (висоту чи площу) приймають за вказівкою викладача. Для розрахунку вмісту компонентів у досліджуваній суміші використовують формулу:

3.2.3. Метод внутрішнього стандарту

Метод внутрішнього стандарту використовується у тих випадках, коли неможливо зафіксувати піки всіх компонентів при допомозі хроматографа (наприклад, коли використовується селективний детектор) або немає необхідності визначати концентрації всіх компонентів суміші. Метод дає правильні результати навіть при аналізі проб, які випаровуються тільки частково.

Цей метод передбачає додавання до визначеної кількості g_сум аналізованої суміші відомої кількості g_ст внутрішнього стандарту (мітки) – речовини, яка не міститься в досліджуваному зразку. В якості внутрішнього стандарту вибирають речовину, близьку за фізико-хімічними властивостями (структура, леткість) до компонентів суміші, абсолютно інертну, добре змішувану з пробою, без домішок (максимум 1-2%). Після хроматографування вимірюють параметри піків аналізованого компоненту і стандартної речовини.

Принцип методу полягає у співставленні деякого параметру хроматографічного піку Р_х (площі, висоти піку чи добутку висоти на час утримання) визначуваного компоненту з аналогічним параметром Р_ст. іншої сполуки (мітки), яка додається у відомій кількості до проби.

Концентрацію компонентів в аналізованій пробі знаходять за формулою:

,

де P_i^x, P^x_ст – виміряні кількісні параметри хроматографічних піків і-того компоненту і стандартної речовини;

k_i – калібрувальний множник для визначуваної сполуки відносно речовини внутрішнього стандарту;

g^x_ст, g^x_сум – маси стандартної речовини та аналізованої проби, зважені і змішані перед виконанням аналізу.

Метод внутрішнього стандарту має переваги перед двома попередніми, тому що при його використанні немає необхідності у визначенні повного складу суміші і результати аналізу не залежать від величини проби. Але він потребує виконання допоміжних операцій з підбору і додавання стандартної речовини.

Порядок виконання аналізу. В окремій посудині готують калібрувальну суміш, яка складається з окремого компонента досліджуваної суміші і речовини-стандарту. 2-3 мкл цієї суміші тричі вводять в хроматограф і фіксують її хроматограми. Калібрувальну суміш готують для кожного компонента досліджуваної суміші. Результати вимірювань записують у таблицю.

Калібрувальна суміш		Досліджувана суміш
gст		gxст
gі		gxсум
Pi		Pix
Pст		Pxст