Материалы и методы. Регистрация спектров поглощения сухих гемоглобиновых пятен.

Мы включили спектрофотометр. Включение осуществляется путем последовательного включения входящих в него блоков: общего источника питания всей установки, стабилизатора напряжения; источника питания лампы накаливания; рН-метра и источника питания фотодетектора. При этом на приборах светились индикаторные лампы, указывающие на факт их включения. Настроили рН-метр при закрытой шторке кюветного отделения и включенном источнике питания ФЭУ на 0 с помощью регулировочной ручки «STD1» на передней панели прибора.

Последовательно приготовили три образца, каждый из которых был сделан незадолго до окончания измерения спектра поглощения предыдущего. На первую из пластинок по центру нанесли 0,02 мл крови, на вторую – 0,04 мл, на третью – 0,06 мл. С помощью простого, хорошо заточенного, карандаша нанесенную кровь осторожно распределили по поверхности пластины, стараясь получить пятна круглой формы диаметром 10-15 мм. Пластины с нанесенным гемоглобином подсушили, так что капля не стекала.

Затем проводились измерения спектров поглощения пятен гемоглобина в спектральной области 400-700 нм. Для этого пластину с пятном гемоглобина установили в кюветодержатель и закрепили ее там прижимной пружиной. Кюветодержатель с образцом установили в выходную апертуру кюветного отделения спектрофотометра, при этом шторка фотодетектора была закрыта. Настроили монохроматор спектрофотометра на длину волны тестирующего излучения 580 нм.

Открыли выходную щель монохроматора до максимума. С помощью ручки регулировки ширины ирисовой диафрагмы и винтов регулировки положения тестирующего светового зонда добились максимального совпадения границ гемоглобинового пятна и светового зонда.

После чего извлекли кюветодержатель из выходной апертуры кюветного отделения, извлекли пластину с гемоглобиновым пятном из кюветодержателя, а «пустой» кюветодержатель вернули в кюветное отделение на прежнее место. Закрыли кюветное отделение и светоизолировали его, накрыв тканью. Открыли шторку фотодетектора.

Постепенно уменьшая ширину выходной щели монохроматора, добились того, чтобы величина регистрируемого фотосигнала составляла 1000 мВ. Перенастроили монохроматор на 400 нм и замерили величину фонового сигнала. Измерения проводились с шагом в области 400-440 нм – 2 нм; в области 440-520 нм – 5 нм; в области 520-590 нм – 2 нм; 590-700 нм – 10 нм.

Окончив измерения фонового сигнала, закрыли шторку фотодетектора, открыли кюветное отделение, извлекли кюветодержатель, возвратили пластинку с гемоглобиновым пятном в кюветодержатель, а его – в кюветное отделение. Проверили, насколько хорошо границы гемоглобинового пятна совпадают с границами светового зонда. Для этого, предварительно записав ширину выходной щели, на которой регистрировались величины фонового сигнала, открыли эту щель и настроили монохроматор на зеленое излучение. Поворачивая кюветодержатель в отверстии выходной апертуры, добились его «вписывания» в световой пучок, не изменяя положение светового зонда на образце и ширину ирисовой диафрагмы.

По достижении максимально возможного «вписывания» гемоглобинового пятна в световой зонд, закрыли крышку кюветного отделения, светоизолировали его, вернули ширину выходной щели монохроматора к той величине, которую она имела во время измерения фонового тока, настроили монохроматор на 400 нм и измерили зависимость J=f(). Измерения проводились на тех же длинах волн, где регистрировалась величина фонового тока.

Закончив измерения, пластину с гемоглобиновым пятном поместили в стеклянный стаканчик и залили 4 мл дистиллированной воды. Как только пятно смылось, образец перелили в кювету и измерили оптическую плотность при 578 и 620 нм на спектрофотометре СФ-46.

При измерении спектров поглощения следующих образцов настроили спектрофотометр таким образом, чтобы эта зависимость была такой же, как уже измеренная. Для этого новый образец поместили в кюветодержатель, который устанавливается в кюветное отделение. Затем монохроматор настроили на длину волны 580 нм, его выходная щель максимально раскрывается, и выполняется «вписывание» нового пятна в световой зонд. Затем пластину с пятном извлекли из кюветодержателя, который возвращается в кюветное отделение. Крышку кюветного отделения закрыли, оно светоизолируется. После открыли шторку фотодетектора. Потом постепенно закрывали выходную щель монохроматора, доводя сигнал фотодетектора до 1000 мВ. Ширину щели, при которой это было достигнуто, записали. Далее измерения проводились также, как и при анализе зависимости J=f() для первого пятна.