Лабораторные методы диагностики сифилиса

Российский национально исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова

Кафедра дерматовенерологии педиатрического факультета

Доклад на тему: Лабораторные методы диагностики сифилиса

Выполнил: Студент 440 в группы

Педиатрического факультета

Серанов Игорь Анатольевич

2013 годъ

Содержание

1. Нетрепонемные исследования

2. Трепонемные исследования

3. Комплекс проведения серологических реакций

4. Реакция Вассермана

5. Реакция иммунофлюоресценции

6. Реакция имунного прилипания

7. Реакция иммобилизации бледных трепонем

8. Реакция иммунофлюоресценцией адсорбцией бледных трепонем

9. Реакция гемагглютинационная

10. Иммуноферментный анализ

11. Полимеразная цепная реакция

Все серологические методы исследования, которые применяются на сегодня, условно разделяются на два вида: нетрепонемные, отборочные (НТТ)- и трепонемные, которые подтверждают наличие возбудителя (ТТ).Сифилис протекает очень сложно, клиника очень смазана и не всегда проявляется, поэтому для постановления правильного диагноза используют сразу несколько серологических тестов. При визуалированном подтверждении присутствия во взятом материале бледной трепонемы (при помощи микроскопа) диагноз ставится сразу же, и остальные тесты проводятся редко.

Нетрепонемные исследования (тесты) - НТТ - это так называемые отборочные исследования, они не очень дорого стоят и при их помощи можно обследовать достаточно большое число пациентов, к тому же результаты при многих тестах готовы очень быстро. Но при ложном течении заболевания, при низкой чувствительности  проведение таких тестов нецелесообразно, 100%-ный результат получить не удастся.

При проведении нетрепонемных тестов в материале, который исследуется, обнаруживаются антитела, которые реагируют с кардиолипин - лецитиновым антигеном. Одним из первых тестов был метод, основанный на иммунологической реакции Борде - Жангу, где в качестве антигена выступал экстракт печени новорожденного ребёнка, который умер от сифилиса. На сегодня при проведении таких тестов антигеном выступают лецитин, холестерин и кардиолипин.

За границей, в частности в США используют 4 нетрепонемных метода, которые делятся на два вида: методы, которые позволяют визуально определить результаты реакции (RPR и TRUST) и методы микроскопического считывания результатов(USR и VDRL).

К нетрепонемным методам диагностики относится непрямой иммуноферментный анализ с использованием кардиолипина в качестве антигена. У нас в стране и в странах СНГ в качестве нетрепонемных тестов выступают реакция плазмы с инактивированной сывороткой (МР) и реакция, при которой происходит связывание комплимента с кардиолипином (РСК).

Все методы нетрепонемной диагностики очень похожи друг с другом. У них у всех невысокая стоимость, их просто и быстро провести. Эти виды тестов не подходят при выявлении заболевания на первичной стадии и при  сифилисе, который протекает скрытно (латентная форма сифилиса). Антитела, которые определяются нетрепонемным тестом появляются, где то через месяц после инфицирования трепонемой. В большинстве случаев у больных, которые лечили первичную стадию сифилиса, примерно около года нетрепонемные тесты имеют отрицательный результат.

Трепонемные исследования (тесты) - ТТ стоят намного дороже, техника проведения их очень сложная и они используются для подтверждения положительных результатов, которые были получены при нетрепонемных исследованиях.

Как мы говорили выше трепонемные методы применяют для того, чтобы подтвердить наличие бледной трепонемы в организме, которое было выявлено при помощи нетрепонемных тестов. Так же их проводят, если проводимые анализы так и не дали положительного результата, но клиника предполагает наличие заболевания. После полного излечения сифилиса более чем у 80% вылечившихся наблюдается положительная реакция при проведении трепонемных тестов     ещё несколько лет, а у некоторых - всю жизнь. Исходя из этого трепонемные тесты не используют для профилактических осмотров у людей, которые прошли полный курс лечения.

Научные исследования в области иммунологии и молекулярной биологии продолжаются постоянно и при помощи новейших технологий появляются всё новые тесты для диагностики сифилиса, которые прочно занимают лидирующие позиции. Один из таких тестов, который прочно вошёл в практику - иммуноферментный анализ (ИФА), а многие исследовательские методы находятся на стадиях разработки.

Тот комплекс проведения серологических исследований, который проводят в России включает в себя комплексное проведение серологических реакций: 

стандартных серологических реакций –

• реакцию связывания комплемента(реакция Вассермана),

• реакцию с трепонемным антигеном и реакцию с кардиолипином;

груповых трепонемных реакций-

• реакцию иммунофлюоресценции (РИФ)

• реакцию иммунного прилипания(РИП);

видоспецифических протеиновых трепонемных реакций –

• реакцию иммобилизации трепонем(РИТ),

• РИФ - абс и её варианты (IgM-FTA-ABS, 19S-IgM-FTA-ABS),

• реакцию пассивной гемаглюцинации трепонем(РПГА).

Если серологические реакции использовать в комплексе, это даст возможность выявить заболевание на ранних этапах заболевания.

Реакция Вассермана - это метод связывания комплемента. Для проведения реакции в качестве антигена используют экстракты, которые изготавливаются из бледных трепонем (специфические антигены) и кардиолипин - это экстракт приготовленный из сердечной мышцы быка(неспецифические антигены). Чем больше в исследуемом материале наблюдается бледных трепонем, тем больше степень заболевания и оценивают степень плюсами:                            

1) -  отрицательная;                                     2) + сомнительная;                                     3) ++ слабоположительная;                                 4) +++ положительная;                                     5) ++++    резкоположительная.                                

Реакцию Вассермана (Реакция связывания комплемента) в обязательном порядке проводят вместе с осадочными реакциями – Закс - Витебского и Кана. Иммунологическая природа реакций, в общем- то такая же, как и у реакции Вассермана, но для этих реакций требуются более насыщенные антигены, которые при вступлении в реакцию с реагинами сыворотки дают больший осадок. Серонегативный первичный сифилис ставят, если стандартные серологические реакции дали отрицательный результат. Выявление сифилиса реакцией Вассермана эффективно при серопозитивном вторичном сифилисе, здесь результаты теста на 100% верны. На третичной стадии активного сифилиса результаты верны у  более половины больных, а на последних стадиях сифилиса, при поражении внутренних органов и систем, результаты верны у половины больных. У больных ранним врождённым сифилисом серологические реакции дают положительный результат почти всегда, а у больных с поздним врождённым сифилисом - почти в 80% случаев.

Принцип РСК заключается в том, что реагины, находящиеся в сыворотке крови больных сифилисом, обладают свойством вступать в соединения с различными антигенами. Образовавшиеся комплексы сортируют введенный в реакцию комплемент. Для индикации комплекса реагины–антиген–комплемент используется гемолитическая система (смесь эритроцитов барана с гемолитической сывороткой). При наличии комплекса эритроциты выпадают в осадок. Что заметно не вооруженынм глазом. Выраженность гемолиза обозначается врачом ключами: резко положительная 4+, положительная 3+, слабоположительная 2+ ли 1+ и отрицательная. Кроме качественной оценки этих реакций имеется и количественная, имеющая значение в диагностике некоторых стадий сифилиса и при контроле за эффективностью терапии

Реакция иммунофлуоресценции (РИФ) основана на выявлении антител, которые метят специальным флуоресцентным раствором, для того, чтобы в фиолетовых лучах кварцевой лампы выявить соединённые с антигеном антитела. Эта реакция имеет высокую чувствительность и помогает выявить заболевание на первичной стадии серонегативного сифилиса. Так же именно этот тест помогает выявить заболевание у пациентов, у которых заболевание протекает латентно или на поздних стадиях. Существует несколько типов таких реакций и наиболее высоко ценится РИФ-200, при помощи, которой можно выявлять скрытый сифилис и распознать неспецифические результаты КСР. Но, несмотря на высокие показатели РИФа-200, постановка диагноза происходит после проведения всех клинических анализов. РИФ не подходит для наблюдения за пациентами после проведения полного лечения, так как достаточно медленно негативируется на этапе проведения лечения.    

Реакция иммуного прилипания (РИП). В основе этой реакции лежит прилипание трепонем, которые сенсибилизированны сывороткой, к эритроцитам и выпадение их в осадок. Результаты оцениваются по следующей таблице:

-отрицательная- 0-20%

-сомнительная-21-30%;

-слабоположительная-31-50%;

-положительная-51-100%.

По всем показателям РИП очень похожа на РИФ  и РИТ. Эта реакция проводится в нескольких случаях, если на основании клинических проявлений, анамнеза, лабораторных исследований сифилис не подтверждается, для контроля за заболеванием после получения необходимого лечения и для подтверждения результатов КСР.  

                                      Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИТ).Попав в среду, где есть иммобилизины испытуемой сыворотки и активный комплемент, бледные трепонемы теряют подвижность. На этом и основывается эта реакция. РИТ очень специфична и применяется для распознания скрытого сифилиса, для диагностики беременных , у которых подозревают сифилис и многих других случаев, при которых стандартные серологические  тесты     мало специфичны. Большой недостаток этой реакции то, что она стоит очень дорого и её проведение - очень сложный процесс. Результаты считываются по процентным данным иммобилизации бледных трепонем:

-отрицательная - до 20%;                                 -сомнительная -21-30%;                                 -слабоположительная -31-50%;                             -положительная -51-100%.                                

В связи с тем, что иммобилизины появляются в крови позже других антител, реакция становится положительной немного позже, чем при проведении других реакций. На первичном этапе инфицирования, как правило, наблюдается отрицательная или слабоположительная реакция. На вторичном этапе сифилиса, хотя появление иммобилизинов  в сыворотке крови у больного наблюдается до 60%, реакция положительна почти у половины исследуемых. При рецидиве вторичной стадии сифилиса РИТ положительна почти у 90% больных. На третичной стадии развития сифилиса, при поражении внутренних органов, в том числе и нервной системы, когда  реакция Вассермана даёт отрицательные результаты, реакция иммобилизации бледных трепонем положительна почти у 100% больных. На раннем этапе врождённого сифилиса реакция имеет  положительный результат почти у всех больных, а на позднем этапе врождённого сифилиса - почти у 100% больных. Серопозитивный латентный сифилис подтверждается только после проведения РИТ, которую проводят после получения положительных результатов при проведении других серологических реакций. РИТ не применяют для контроля за заболеванием у больных, которые получили необходимое лечение.

Реакция иммунофлуоресценции абсорбции с бледной трепонемой (FTA-ABS).Если реакцию проводят для больного, который болен сифилисом и не лечился, то тогда эта реакция даёт положительный результат всегда. Так же высока вероятность выявить инфекцию при помощи FTA-ABS в самом начале заболевания. Реакция обладает большой чувствительностью и специфичностью. Для диагностики  латентного сифилиса и в тех случаях, когда уже было проведено несколько тестов и они показали отрицательный результат, но клиника говорит о инфицировании бледной трепонемой, в таких случаях диагноз ставят часто опираясь на результаты FTA-ABS.             Буквально через неделю после того, как бледная трепонема попала в организм, начинают вырабатываться специфические антитела IgM, которые со временем перестают появляться и через 2 года уже не определяются. Для того, чтобы понять даёт ли предложенное лечение эффект, проводят специальные тесты, которые определяют специфичность этих антител. Таких тестов на сегодня есть несколько, но проведение их слишком дорого, поэтому для большинства больных эти тесты не проводят.

Гемагглютинационная реакция, которая определяет специфические антитела к бледной трепонеме (микро-РПГА). Для этой реакции в качестве антигена служат трепонемы, поэтому эта реакция очень специфична и даёт правдивые результаты в большинстве случаев.

Иммуноферментный анализ (ИФА) один из наиболее специфичных для диагностики сифилиса. На сегодня чаще всего используют непрямой вариант ИФА. Преимущества этого метода исследования очевидны: не слишком большая стоимость, лёгкость проведения, достаточна высокая точность результата, при помощи этого анализа можно выявить сифилис на ранней стадии, быстрое получение результатов.

В основе метода иммуноблотинга лежит иммуноферментный анализ, который сочетается с электрофорезом. Является одним из самых специфичных анализов и при его помощи происходит подтверждение инфицирования сифилисом.

Полимеразную цепную реакцию (специфический метод исследования) проводят для установления диагноза при скрытых течениях сифилисной инфекции. При проведении ПЦР в испытуемом материале находят возбудителя, даже на первичном этапе заболевания. Обнаруживаемый генетический материал при помощи ДНК делится и таким образом обнаружить возбудителя становится очень просто. При нейросифилисе, когда выявить инфекцию бывает очень затруднительно при проведении других анализов из-за очень низкой чувствительности, при врождённом сифилисе, при первичной стадии серонегативного сифилиса и для постановки диагноза у ВИЧ-инфицированных проведение ПЦР незаменимо.                                              Исследование спинномозговой жидкости при сифилисе проводят, если есть клинические поражения нервной системы на ранней стадии заболевания, при скрытой форме и обязательно ещё до начала лечения. Так же этот анализ назначается для больных нейросифилисом на поздних стадиях сифилиса и при латентной форме. В клинической лаборатории проводят исследование цитоза, содержание белка, реакции Панди и Нонне - Апельта. В серологических лабораториях проводится реакция Вассермана, реакция Ланге, РИФ, РИФю,РИФц, РИТ.