Лабораторная работа №3.

Количественная фотометрия неоднородных биологических объектов.

Цель работы состоит в практическом овладении навыками регистрации спектров поглощения неоднородных объектов (на примере сухих гемоглобиновых пленок) и освоении метода расчета относительной массы хромофора в них.

Приборы и принадлежности:

1. Спектрофотометр на базе модифицированного СФ-4А.

2. Стеклянные пластины для нанесения гемоглобиновых пятен.

3. Кюветодержатель для сухих образцов со встроенной светорассеивающей пластиной.

4. Эритроциты кролика.

Теоретическое введение.

Спектрофометрия используется в биологии и медицине в основном для решения четырех проблем: качественного анализа исследуемых систем, количественного определения веществ, изучения физико-химического состояния биомолекул и определения поперечного сечения поглощения, знание которого часто требуется для расчетов квантовых выходов фотобиологических процессов.

Количественный спектрометрический анализ веществ проводится на основе закона Бугера-Ламберта-Бера:

D = lg J₀/J = -lg T = ecl

где D – оптическая плотность; J₀ и J – интенсивность падающего и вышедшего из образца пучка света; T – пропускание образца; С – концентрация поглощающего вещества, выраженная в моль/л; l – толщина образца, см; ε – молярный коэффициент поглощения, л/(моль*см) или 10³см²/моль или 10^-1м²/моль.

Количественное определение вещества по результатам измерении спектров поглощения можно проводить в том случае, если исследуемый объект удовлетворяет всем требованиям закона Бугера-Ламберта-Бера: 1) поглощающие молекулы распределены по всему образцу равномерно; 2) поглощающие молекулы в пределах исследуемых концентраций не изменяют характера взаимодействия друг с другом и молекулами среды (ε постоянен); 3) выходящий световой поток ослаблен только за счет поглощения фотонов (светорассеяние, отражение, люминесценция и другие явления не влияют на регистрируемый световой поток); 4) интенсивность измеряющего светового пучка и время жизни поглощающих молекул в возбужденном состоянии таковы, что концентрация невозбужденных (способных поглощать свет) молекул не изменяется в ходе измерения; 5) измеряющий световой пучок не вызывает фотохимических изменений поглощающих молекул.

Но одной из серьезных трудностей количественного спектрофотометрического анализа многих биологических систем заключается в их неоднородности (негомогенности), выражающейся в том, что концентрация анализируемого вещества варьирует по площади исследуемого объекта. В этом случае он не удовлетворяет одному из основных требований закона Бугера-Ламберта-Бера. Концетрация вещества по площади объекта может разной по двум причинам. 1) Объект обладает неровной поверхностью, хотя локальная концентрация поглощающих молекул одинакова во всех тех участках, где вещество вообще имеется. Самым простым примером такого типа объектов может быть раствор, помещенный в кювету с неровными стенками. 2) Локальная концентрация вещества изменяется по всему объему объекта в зависимости от всех трех координат, хотя его поверхность ровная. Чаще бывает, что исследуемый образец страдает обоими недостатками. В любом случае в теории массу вещества можно мысленно стянуть в плоскость, на которую перпендикулярно падает измерительный пучок света, и учитывать только изменение плотность вещества по площади этой плоскости.

В сравнении с объектами, хромофорные соединения в которых распределены равномерно, неоднородные объекты поглощают свет слабее, а спектры их поглощения «сглажены». Поскольку прямое измерение количества хромофора в объекте с его неоднородным распределением дает заниженные значения, при фотометрии таких объектов требуется внесение поправок. Можно, например, фотометрировать объект не в максимуме поглощения определяемого вещества, а при тех длинах волн, где его оптическая плотность относительно невелика. При небольших значениях оптической плотности ошибка ее определения в неоднородных объектах также будет относительно невелика. Но такой подход значительно снижает чувствительность фотометрического анализа. Поэтому чаще прибегают к другому приему, основанному на определении оптической плотности неоднородного объекта при двух длинах волн тестирующего излучения. Рассмотрим теоретические основы этого метода.