Вторинні месенджери та їх роль в механізмах гормонального впливу на клітини-мішені:

• цАМФ (структура, біологічна дія);

• цГМФ (структура, біологічна дія);

• фосфоінозитиди;

• іони кальцію.

9. Протеїнкінази – мішені для цАМФ.

10. Реалізація впливу адреналіну на клітини-мішені. Схема каскадного посилення сигналу

11. Цитокіни – спеціальний клас білкових сигнальних молекул (аналогічних нейротрансмітерам і гормонам), що регулюють різні клітинні функції і міжклітинні взаємодії:

• інтерлейкіни;

• інтерферони;

• фактори некрозу пухлин;

• колонієстимулюючі фактори;

• трансформуючі ростові фактори;

12. Цитокінова система:

• як мікроендокринна система, її зв’язок з імунною, нервовою, ендокринною, кровотворною та ін. системами;

• як система регуляторів функціональної активності клітин (пошкодження, регенерації, апоптозу).

13. Рецептори стероїдних та тиреоїдних гормонів:

• зв’язування в тканинах-мішенях із специфічними цитозольними рецепторами;

• стероїдні та тиреоїдні рецептори ДНК-хроматинового комплексу;

14. Молекулярні механізми дії стероїдних та тиреоїдних гормонів:

• проникнення гормону в клітину;

• зв’язування гормону з цитозольним рецептором;

• модифікація (активація) рецептора в складі гормоно-рецепторного комплексу;

• транслокація модифікованого гормоно-рецепторного комплексу в клітинне ядро;

• взаємодія комплексу із чутливими сайтами ДНК ядерного хроматину (вплив безпосередньо на хромосоми);

• активація специфічних генів;

• стимуляція транскрипції (утворення мРНК);

• синтез ферментних білків, що реалізують біологічні ефекти гормону (як приклад, навести один із ефектів тироксину).

15. Біосинтез та секреція тиреоїдних гормонів

16. Аналізувати принципи прямого і зворотнього зв’язку в регуляції вивільнення Т₃ та Т₄ із щитовидної залози, що, в свою чергу, залежить від вмісту цих гормонів в крові.

17. Вплив Т₃ та Т₄ на метаболічні процеси: обмін вуглеводів, ліпідів, амінокислот, вітамінів.

18. Гіпертиреоз.

19. Гіпотиреоз.

20. Стероїдні гормони: схема їх синтезу, шляхи інактивації, роль в організмі; кортикостероїди:

• глюкокортикоїди (кортизол та ін.);

• мінералокортикоїди (альдостерон та ін.);

• прогестагени (прогестерон);

• естрогени (естрон, естрадіол);

• андрогени (тестостерон, дигідротестостерон).

Практичні роботи

Завдання 1. Визначити гормони білкової природи (реакції осадження).

Принцип методу. Білки легко осаджуються під дією ряду агентів, в тому числу і органічних кислот. Осадження білків і, зокрема, білків-гормонів сульфосаліциловою кислотою є чутливою та високо специфічною реакцією на їх виявлення в розчині.

Матеріали і реактиви: 20%-й розчин сульфосаліцилової кислоти, розчин інсуліну для ін’єкцій.

Хід роботи. В пробірку вносять 1,0 мл досліджуваного розчину інсуліну і додають 3 краплі 20%-го розчину сульфосаліцилової кислоти. При наявності в розчині інсуліну спостерігають за утворенням осаду.

Пояснити механізм осадження білків з розчину під дією сульфосаліцилової кислоти.

Завдання 2. Провести біуретову реакцію з гормонами білкової та пептидної природи.

Принцип методу. Як речовина білкової природи, інсулін дає ряд реакцій, специфічних для білків (біуретову реакцію, Фоля, з азотною кислотою та ін.). Білки і пептиди взаємодіють з CuS0₄ в лужному середовищі, утворюючи комплексні сполуки. Реакція обумовлюється наявністю пептидних зв’язків. Утворена комплексна сполука міді (біуретовий комплекс) має фіолетове забарвлення.

Матеріали та реактиви: 5%-й розчин NaOH, 1%-й розчин CuS0₄; розчини: інсуліну, АКТГ, пролактину.

Хід роботи. В пробірку вносять 5 крапель досліджуваного розчину, 5 крапель 5%-го розчину NaOH, 1 краплю 1%-го розчину CuSO₄. Спостерігають за появою рожево-фіолетового забарвлення. В суміші не повинно бути надлишку сульфату міді, оскільки утворений за цих умов гідроксид міді, може змінювати колір розчину.

З проведеного дослідження зробити висновки.

Завдання 3. Провести реакцію на гормон підшлункової залози (інсулін) з азотною кислотою.

Принцип методу: при взаємодії білка з азотною кислотою утворюється осад.

Матеріали та реактиви: концентрована HNO₃. Розчин інсуліну в ампулах.

Хід роботи: До 1,0 мл концентрованої азотної кислоти, обережно по стінці пробірки, внести такий самий об’єм розчину інсуліну. На межі двох рідин утвориться білий аморфний осад у вигляді невеликого кільця.

Завдання 4. Визначити йодвмісні гормони (тироксин, Т₃ та Т₄) в біологічних рідинах.

Принцип методу. Гормони щитовидної залози (тироксин, трийодтиронін) містять в своєму складі йод. В процесі їх лужного гідролізу (кип’ятіння з КНСО₃) утворюється йодид калію (KJO₃). Вільний йод легко витісняється з йодиду калію при дії на нього йодату калію (KJ) в кислому середовищі згідно рівнянню:

5KJ + KJO₃+ 3H₂SO₄  3J₂ + 3K₂SO₄ + 3H₂O

Молекулярний йод, що виділяється, дає синє забарвлення з крохмалем:

J₂ + крохмаль  синє забарвлення

Матеріали та реактиви: 10%-й розчин H₂SO_4, 1%-й розчин крохмалю, 2%-й розчин KJO₃, лакмус, лужний гідролізат гормонів щитовидної залози.

Хід роботи. До 1,0 мл лужного гідролізату гормонів щитовидної залози додають сірчану кислоту до кислої реакції на лакмус, 2 краплі 1%-го розчину крохмалю і 5 крапель 2%-го розчину йодату калію. З’являється синє забарвлення.

За результатами проведеного дослідження зробити висновки.

Завдання 5. Провести якісну реакцію на фолікулін (естрон) – жіночий статевий гормон.

Принцип методу. Фолікулін з сірчаною кислотою забарвлюється в жовтий колір, який при нагріванні переходить в жовто-гарячий.

Матеріали та реактиви: спиртовий розчин фолікуліну, концентрована сірчана кислота.

Хід роботи. У пробірку вносять 0,5 мл спиртового розчину фолікуліну і ставлять її на водяну баню на 10 хв. для видалення спирту. До фолікуліну, що залишився в пробірці, добавляють 6,0 мл концентрованої сірчаної кислоти і пробірку знову ставлять на водяну баню на 10 хв. Рідина в пробірці забарвлюється в жовтий колір, який при нагріванні переходить в жовто-гарячий із зеленою флюоресценцією.

Клініко-діагностичне значення. Інсулін регулює вуглеводний обмін, посилює проникнення глюкози в клітини і сприяє її перетворенню в глікоген; понижує вміст глюкози в крові, зменшує її виведення з сечею, позбавляє явищ діабетичної коми. Окрім гіпоглікемічної дії, інсулін спричиняє ряд інших ефектів: підвищує запаси глікогену в м’язах посилює процес ліпогенезу, окислення глюкози до СО₂ по пентозофосфатному шляху, стимулює синтез пептидів, зменшує витрати білка та ін. Норма (сироватка, натщесерце): 29 – 181 пмоль/л. Зниження показника відмічається при цукровому діабеті, ювенільному діабеті (діабет І типу інсулін-дефіцитний), а також при панкреатектомії та ін. При цукровому діабеті ІІ типу гіперглікемія не залежить від вмісту інсуліну, а змінюється структура інсулін-чутливих рецепторів (пострецепторні дефекти), або ж зменшується кількість їх, завдяки чому інсулін перестає діяти на клітини-мішені, а вони, в свою чергу, перестають транспортувати глюкозу в середину клітини. Підвищення вмісту інсуліну спостерігається при цукровому діабеті ІІ типу, ожирінні, уремії, гіперкортицизмі.

Цитокіни (ЦК) регулюють різні клітинні функції і міжклітинні взаємодії, що забезпечує підтримку постійності структур органів і тканин. Фактори росту, що діють подібно гормонам, але відносяться до ЦК, мають широкий спектр біологічної дії на інші клітини – стимулюють чи гальмують мітогенез, хемотаксис, диференціровку клітин. В залежності від конкретних умов ЦК можуть стимулювати або інгібувати відповідні процеси, діяти як сінергісти або антагоністи. Відмічається добовий ритм (циркадність) в послідовності синтезу ЦК, залежність дії від їх концентрації. Адгезія клітин до різних компонентів міжклітинного матриксу зумовлює індукцію синтезу і продукції різних ЦК. ЦК забезпечують також контроль продукції компонентів міжклітинного матриксу. Одночасно ЦК регулюють експресію різних адгезивних рецепторів, які забезпечують міжклітинні і клітинно-матриксні контакти. ЦК є одним із факторів, що визначають перебіг патологічного процесу і його завершення. Вивчення тонких механізмів міжклітинних контактів (взаємодій) в нормі і при патології відкриває перспективу для розробки нових методів імунотерапії.

Гормони Т₃ і Т₄ спричиняють подібний багатогранний вплив на організм: стимулюють ріст, розвиток, статеву зрілість, контролюють морфогенез. Вони здатні впливати на процеси транскрипції генів, а отже на диференціацію клітин і розвиток тканин; Т₃ і Т₄ впливають на функціональний стан нервової і серцево-судинної системи, печінки, нирок; посилюють всмоктування глюкози і її утилізацію. Невеликі дози тироксину спричиняють анаболічний ефект, а великі – посилюють катаболізм білка, розщеплення глюкози і жирів. Активація окислювальних процесів пов’язана з підвищенням поглинання кисню, посиленням енергетичних процесів і витратами енергії в тканинах. Вважають, що більша частина енергії, яка утилізується клітиною використовується для роботи Na⁺, K⁺-АТФ-азної помпи. Гормони щитовидної залози підвищують ефективність цієї помпи. Оскільки всі клітини мають таку Na⁺, K⁺-АТФ-азу і здатні реагувати на тиреоїдині гормони, то підвищена утилізація АТФ і зв’язане з нею збільшене споживання кисню в процесі окисного фосфорилювання може представляти собою основний механізм дії гормонів щитовидної залози. Стимуляція біоенергетичних процесів у тканинах при дії цих гормонів пов’язана, як з підвищенням потреби тканин до кисню (поглинання О₂), так і збільшенням активності мітохондріальних ферментів електронтранспортного ланцюга, що спряжене з синтезом АТФ; проте, під впливом надмірної кількості тироксину на ці ферменти, не відбувається адекватного зростання фосфорилювання АДФ до АТФ, отже відбувається роз’єднання процесів тканинного дихання і окисного фосфорилювання і значна частина енергії розсіюється у вигляді тепла.

Для характеристики функції щитовидної залози найчастіше досліджують вміст у сироватці крові загального тироксину, загального трийодтироніну. Норма: Т₄ (загальний) - 65-156 нмоль/л; Т₃(загальний) 1,04 – 2,5 нмоль/л. Підвищення вмісту Т₃ і Т₄ - при гіпертиреозі, гепатиті, цирозі печінки, акромегалії та ін. Зниження показників – як при первинному гіпотиреозі (локалізація патологічного процесу в щитовидній залозі), так і вторинному (локалізація патологічного процесу у гіпоталамо-гіпофізарній ділянці), застосуванні андрогенів, вживанні кортикостероїдів, аскорбінової кислоти, сульфаніламідів та ін.

Естрон (фолікулін) - відноситься до групи естрогенів, синтезується у фолікулах яєчників – необхідний для нормального розвитку жіночого організму. Естрон разом з прогестероном забезпечують менструальний цикл і виконання функції народження дітей. Специфічна дія – проліферація ендометрія, стимуляція розвитку матки і вторинних статевих жіночих ознак, запобігає розладам, що виникають в організмі жінок на тлі недостатньої функції статевих залоз. Вміст гормону в сироватці крові жінок залежить від фази менструального циклу.

Тема заняття № 5. Дослідження гормональної регуляції метаболізму та клітинних функцій.

Цілі заняття:

• Трактувати механізми дії та особливості синтезу і секреції гормонів залоз внутрішньої секреції.

• Пояснити роль гіпоталамуса у взаємодії вищих відділів центральної нервової системи та залоз внутрішньої секреції.

• Охарактеризувати гормони гіпоталамуса, визначити їх роль у секреторній активності гіпофіза.

• Зробити висновки про роль гормонів гіпофізу у функціонуванні периферичних ендокринних залоз.

• Трактувати патології, пов’язані з порушенням синтезу та секреції гормонів.

• Провести якісні реакції на вміст гормонів в біорідинах (кров, сеча).

Теоретичні питання

1. Ефектори. Секреція ендокринних залоз – як відповідь на різноманітні стимули, що надійшли з нервової системи (напр. секреція інсуліну – при підвищенні вмісту глюкози в крові та виділення хоріонічного гонадотропіну стінками матки на початку вагітності після імплантації бластоцисти, підвищення секреції тироксину при тривалому перебуванні на холоді).

2. Єдиний нейрогуморальний механізм регуляції.

3. Гормони гіпоталамуса:

   • ліберини (соматоліберин, тиреоліберин, гонадоліберин, кортиколіберин, фоліліберин, пролактоліберин, меланоліберин);

   • статини (соматостатин; пролактостатин; меланостатин).

4. Гормони передньої частини гіпофізу (аденогіпофізу):

• група гормону росту:

• СТГ, соматомедини;

• пролактин;

• хоріонічний соматотропін.

• група тропних гормонів:

• тиреотропний гормон;

• гонадотропні гормони (фолікулостимулюючий, лютеїнізуючий,

• хоріонічний гонадотропін).

• група проопіомеланокортину:

• АКТГ;

• ліпотропний гормон;

• ендорфіни;

• меланоцитостимулюючий гормон.

5. Гормони задньої частки гіпофіза (нейрогіпофіза). Їх вплив на гладенькі м’язи та водний баланс організму:

• вазопресин;

• окситоцин.

6. Гормони підшлункової залози:

• інсулін (структура, біосинтез, роль в обміні вуглеводів);

• глюкагон.

7. Гормони шлунково-кишкового тракту:

• гастрин;

• секретин;

• холецистокінін.

8. Біогенні аміни:

• катехоламіни (адреналін, норадреналін, дофамін);

• індоламіни (серотонін, мелатонін);

• гістамін (біологічна дія).

9. Ейкозаноїди: простагландини, тромбоксани.

Практичні роботи

Завдання 1. Провести якісну реакцію на вміст в крові похідних амінокислот – адреналіну та норадреналіну (катехоламінів) – гормонів мозкової речовини наднирників (реакція з хлоридом заліза (ІІІ).

Принцип методу. Адреналін (метиламіноетанолпірокатехін) – гормон мозкової речовини наднирників – дає реакції, характерні для пірокатехінів. З іонами заліза (ІІІ) він утворює сполуку фенолятного типу – смарагдово-зеленого кольору. При подальшому додаванні лугу (NaOH), утворюється адренохром вишнево-червоного кольору.

Матеріали та реактиви: 0,1-% розчин адреналіну, 1-% розчин FeCl₃, 10-% розчин NaOH.

Хід роботи. В пробірку вносять 5 крапель 0,1-% розчину адреналіну і додають 1 краплю 1-% розчину FeCl₃. З’являється смарагдово-зелене забарвлення. До отриманого розчину вносять 1 краплю лугу (NaOH) – з’являється вишнево-червоне забарвлення.

За результатами проведеного дослідження зробити висновок.

Завдання 2. Провести якісну реакцію на гормони мозкового шару наднирників (адреналін, норадреналін) з діазореактивом.

Принцип методу. Адреналін легко окислюється на повітрі, внаслідок чого розчин набуває червоного забарвлення. Характерною реакцією на виявлення адреналіну є також реакція з діазореактивом (суміш розчинів сульфанілової кислоти та нітриту натрію), що супроводжується появою червоного забарвлення.

Матеріали та реактиви: 1-% розчин сульфанілової кислоти, 5-% розчин азотистокислого натрію, 0,1-% розчин адреналіну, 10-% розчин Na₂CO₃.

Хід роботи. В пробірку вносять по 1,0 мл 1-% розчину сульфанілової кислоти і 5-% розчину азотистокислого натрію та 1,5 мл 0,1-% розчину адреналіну і 1,0 мл розчину Na₂CO₃. Перемішують, спостерігають забарвлення розчину в червоний колір.

Завдання 3. Провести якісну реакцію на адреналін з KIO₃.

Принцип методу. Адреналін при взаємодії з KIO₃ та CH₃COOH дає продукти червоно-фіолетового кольору.

Матеріали та реактиви: 0,1-% розчин адреналіну, 10-% розчин KIO₃, 10-% розчин оцтової кислоти.

Хід роботи. У пробірку вносять 2-3 краплі 1-% розчину адреналіну, 2 краплі 10-% розчину KIO₃ і 2 краплі 10-% розчину оцтової кислоти (CH₃COOH). Спостерігати забарвлення розчину.

Завдання 4. Виявити в сечі 17-кетостероїди – метаболіти гормонів кори наднирників і статевих залоз (реакція з м-динітробензолом).

Принцип методу. Поняття „17-кетостероїди” (17-КС) об’єднує стероїди, що містять карбонільну групу біля сімнадцятого атома вуглецю. Це метаболіти стероїдних гормонів кори наднирників та статевих залоз. 17-КС в досліджуваних розчинах виявляють за допомогою м-динітробензолу. Продукт конденсації 17-КС з м-динітробензолом у лужному середовищі дає фіолетово-рожеве забарвлення. Інтенсивність кольору пропорційна кількості 17-КС у сечі, що може бути використано для їх кількісного визначення.

Матеріали і реактиви: 2%-й розчин м-динітробензолу, 30% розчин NaOH, сеча.

Хід роботи. В пробірку вносять 1,0 мл сечі, 5 крапель 30 %-го розчину NаОН, 5 крапель 2%-го розчину м-динітробензолу. Суміш в пробірці перемішують скляною паличкою. Через 2-3 хв. при наявності 17-КС з’являється фіолетово-рожеве забарвлення.

За результатами проведеного дослідження зробити висновок.

Клініко-діагностичне значення. У нормі екскреція 17-КС у чоловіків складає 35 - 87 мкмоль за добу, у жінок – 21 – 49 мкмоль за добу. Максимальну екскрецію 17-КC у чоловіків та жінок спостерігають у 25-річному віці, після чого починається поступове їх зниження.

При стресах кількість 17-КС у крові та сечі зростає.

В залежності від типу патології гіпо- чи гіперфункції надниркових залоз змінюється вміст кетостероїдів. Зокрема, при хворобі Аддісона (гіпофункція), гіпофізарному карликовому рості, гіпотиреозі, важких хворобах печінки (цироз) – екскреція 17-КС зменшується. На противагу цьому, при пухлинах наднирникових залоз (синдром Іценко-Кушинга) спостерігається підвищений вміст 17-КС в сечі.

Паралельне визначення вмісту вільних 17-КС в плазмі крові та сечі дає можливість оцінити функціональний стан кіркової речовини надниркових залоз.

Про функціональний стан статевих залоз роблять висновок по вимірюванню добової екскреції тестостерону – найбільш активного андрогену, який утворюється в організмі людини і до 17-КС не відноситься, однак, в печінці більше половини всього тестостерону перетворюється в андростерон і етіохоланолон, які здатні до кон’югації з глюкуронідом і сульфатом, в результаті чого утворюються водорозчинні сполуки – 17-КС. Добова екскреція тестостерону у чоловіків віком 25-35 років становить у середньому 70 мкг на добу, у жінок – 8 мкг на добу.

Катехоламіни (адреналін та норадреналін) мають широкий діапазон біологічних ефектів: активують процеси вивільнення енергії (стимуляція глікогенолізу, ліполізу), збуджують нервові клітини, проявляють тонізуючий вплив, як на міокард (прискорюють серцебиття), так і на загальне судинне русло (гіпертензивна дія), гладенькі м’язи, зокрема, шлунково-кишкового тракту, нирок, бронхів. Дослідження екскреції катехоламінів дозволяє характеризувати стан симпато-адреналової системи. Катехоламіни діють через два головні класи рецепторів: а-адренергічні і β–адренергічні. Норадреналін в фізіологічних концентраціях зв’язується, головним чином, з а-рецепторами. Симпатична нервова система шляхом вивільнення норадреналіну відіграє центральну роль в мобілізації вільних жирних кислот в жировій тканині (збільшує швидкість ліполізу триацилгліцеролів), що може активувати термогенез (холодова адаптація). Вивільнення жирних кислот, під час тривалого перебування на холоді, призводить до роз’єднання процесів тканинного дихання і окисного фосфорилювання, в результаті чого не утворюється достатня кількість макроергічних сполук, а енергія розсіюється у вигляді тепла. Важливо зазначити, що жирова тканина людини не чутлива до дії більшості гормонів, які стимулюють ліполіз, окрім катехоламінів.

Порушення метаболізму катехоламінів може відігравати суттєву роль в розвитку нервових і психічних захворювань, зв’язаних з виникненням розладів рухового автоматизму і м’язевого тонусу (паркінсонізм), емоційної сфери (аффективна патологія), вищих форм цілеспрямованої діяльності і мислення (шизофренія). Вміст катехоламінів в крові та сечі залежить від плину часу за добу і від різного віку дітей та дорослих.

Тема заняття № 6. Дослідження гормональної регуляції гомеостазу кальцію та фосфатів в організмі.

Цілі заняття:

• Характеризувати гормональний статус організму за показниками кальцій-фосфатного обміну.

• Пояснити сукупну регулюючу дію гормонів – паратгормону, кальцитоніну та сполуки гормонального типу дії – кальцитріолу на вміст кальцію і фосфатів в плазмі крові.

• Проаналізувати особливості розподілу кальцію в організмі (загальна кількість в організмі, розподіл в клітинах, форми кальцію в плазмі крові).

• Зробити висновки про роль остеобластів та остеокластів в контролі кальцієвого і фосфатного гомеостазу.

• Пояснити гіпер- та гіпокальціємічні ефекти та механізми дії паратгормону, кальцитріолу та кальцитоніну.

• Аналізувати основні порушення кальцієвого гомеостазу.

• Провести якісні реакції на вміст кальцію і фосфатів в крові.

Теоретичні питання

1. Вміст кальцію в організмі, його розподіл на внутрішньоклітинний та позаклітинний.

2. Внутрішньоклітинна локалізація та функції кальцію.

3. Кальцій плазми крові, його три основні молекулярні форми:

• іонізований кальцій;

• кальцій, зв’язаний з білками;

• кальцій у вигляді слабо дисоціюючих солей з аніонами органічних та неорганічних кислот.

4. Гомеостаз кальцію в організмі:

• роль остеобластів та остеокластів в регуляції кальцієвого гомеостазу;

• абсорбція та реабсорбція кальцію і фосфатів в тонкому кишечнику;

• роль нирок в реабсорбції кальцію і фосфатів.

5. Паратгормон (гіперкальціємічний гормон), будова та вплив на обмін кальцію і фосфатів в тканинах:

• у кістковій тканині;

• в нирках;

• у кишечнику.

6. Кальцитонін (гіпокальціємічний гормон): будова, біологічні функції.

7. Кальцитріол (1,25-дигідроксихолекальциферол): будова, біосинтез, біологічні функції.

8. Порушення кальцієвого гомеостазу:

• остеопороз;

• гіперпаратиреоз;

• рахіт;

• остеомаляція;

• остеопетроз.

Практичні роботи

Завдання 1. Провести якісну реакцію на вміст кальцію в плазмі крові (реакція з оксалатом амонію).

Принцип роботи. При внесенні до плазми крові насиченого розчину оксалату амонію – випадає білий осад.

Матеріали і реактиви: проба № 1 містить плазму крові здорової людини, в пробі №2, №3 - плазма крові двох хворих пацієнтів; оксалат амонію.

Хід роботи. В три пробірки внести по 1,0 мл плазми крові відповідно проб № 1, № 2, № 3. В кожну з пробірок внести по 1,0 мл насиченого розчину щавлевокислого амонію (оксалат амонію). Спостерігати за помутнінням розчину та випаданням білого осаду щавелевокислого кальцію. За ступенем помутніння розчину і кількістю утвореного осаду зробити висновки про вміст кальцію в пробах, а також про гормональний статус організму.

Завдання 2. Провести якісну реакцію на вміст фосфатів в плазмі крові (реакція з молібденовокислим амонієм).

Принцип роботи. При нагріванні плазми крові з молібденовокислим амонієм утворюється осад жовтого кольору.

Матеріали і реактиви: проба № 1 містить плазму крові здорової людини, в пробі №2, №3 - плазма крові двох хворих пацієнтів; молібденовокислий амоній.

Хід роботи. В три пробірки внести по 0,5 мл плазми крові відповідно проб № 1, № 2, № 3. В кожну з пробірок внести по 1,0 мл молібденового реактиву (молібденовокислого амонію) і прокип’ятити декілька хвилин. Розчин жовтіє і при охолодженні утворюється жовтий осад фосфо-молібдату амонію. За кількістю утвореного осаду зробити висновки про вміст фосфатів в пробах.

Клініко-діагностичне значення. Кальцій приймає активну участь в процесах нервово-м’язевого збудження (як антагоніст іонів К⁺), м’язевого скорочення, згортання крові. Утворює структурну основу скелету, впливає на проникність клітинних мембран. В плазмі крові приблизно половина загальної кількості кальцію зв’язана з білками і половина знаходиться у вільній іонізованній формі. Рівень кальцію в крові є результатом рівноваги процесів всмоктування кальцію в кишечнику, обміну в кістках, реабсорбції і виведення в нирках. Дані процеси контролюються гормонами: паратиреоїдним, кальцитоніном і “гормонально” активною формою вітаміну D (кальцитріолом). Всі ці фактори забезпечують стабільність рівня кальцію в крові. Норма: кальцій сироватки крові (загальний) – 2,25 – 3,0 ммоль/л. Підвищення вмісту кальцію (гіперкальціемія) спостерігається при паратиреоїдизмі, лейкозах, деструктивних процесах в кістковій тканині, гіпервітамінозі Д, хворобі Аддісона, синдромі Іценко-Кушинга, акромегалії, жовтяниці та ін. Зниження вмісту кальцію (гіпокальціемія) – при авітамінозі Д (рахіт), недостатній функції паращитовидних залоз, нефрітах, нефрозах, отруєнні фторидами, гострому панкреатиті та ін. При зниженні вмісту кальцію в крові нижче 1,8 – 1,5 ммоль/л – гіперрефлексія і тетанія. Велике діагностичне значення має співвідношення кальцій/фосфат. В нормі цей коефіцієнт - 1,9 – 2,0; при рахіті - 3,0 і більше. Вміст фосфату в сироватці крові в нормі становить 1,0 - 1,5 ммоль/л. Фосфат міститься в скелеті – кістках і зубах (90%) та внутрішньоклітинно. Як головний внутрішньоклітинний аніон фосфат входить до складу фосфорних ефірів, коензимів, білків, нуклеїнових кислот, АТФ, ліпідів та ін. За участю фосфату відбуваються реакції фосфорилювання. Неорганічні фосфати містяться в буферних системах крові і тканинній рідині. Фосфат активує всмоктування іонів кальцію в кишечнику. Підвищення вмісту фосфату (гіперфосфатемія) – при нефритах, нефрозах, акромегалії, гіпервітамінозі Д, захворюванні кісток, цукровому діабеті, синдромі Іценко-Кушинга та ін. Зниження вмісту фосфату (гіпофосфатемія) – при гіперпаратиреозі, спру, мікседемі, неправильному харчуванні та ін. Зниженням вмісту фосфату в крові вважається рівень його нижче 1,0 ммоль/л.

Тема заняття № 7. Контрольна робота.

Цілі заняття:

• Систематизувати знання студентів.

• Оцінити знання студентів

Перелік індивідуальних завдань для самостійної роботи студентів.

Створення схем в електронному варианті з наступних тем:

• Реплікація і транскрипція ДНК.

• Регуляція експресії генів.

• Репарація ДНК, комплекс репаративних ферментів.

• Механізми дії білково-пептидних гормонів і катехоламінів на клітини-мішені.

• Механізми дії стероїдних і тіреоїдних гормонів на клітини-мішені.

Модуль 3. Біохімія тканин та фізіологічних функцій.

Змістовий модуль 16. Біохімія харчування людини. Вітаміни як компоненти харчування.

Тема заняття № 1. Механізми перетравлення поживних речовин в травному тракті.

Цілі заняття:

• Трактувати фізіологічні потреби та енергетичну цінність основних поживних речовин – складових компонентів харчування людини: білків, вуглеводів, ліпідів та незамінних компонентів: вітамінів, мікроелементів.

• Пояснювати біохімічні механізми ферментативних процесів травлення та надходження до тканин складових компонентів нутрієнтів при розщепленні білків, вуглеводів і ліпідів.

• Пояснювати біохімічні механізми виникнення основних патологічних процесів, спадкових та набутих ензимопатій травлення в шлунку та кішківнику.

Теоретичні питання:

1. Компоненти харчування людини, потреби організму в поживних сполуках.

2. Загальна характеристика перетравлення поживних речовин.

3. Біохімічні механізми перетравлення білків:

   • ферменти перетравлення білків в окремих відділах травного каналу.

4. Біохімічні механізми перетравлення вуглеводів:

   • ферменти перетравлення вуглеводів в окремих відділах травного каналу.

5. Біохімічні механізми перетравлення ліпідів:

   • ферменти перетравлення ліпідів в окремих відділах травного каналу.

6. Порушення перетравлення окремих нутрієнтів в шлунку та кишечнику;

7. Cпадкові ензимопатії процесів травлення:

• біохімічні зміни при порушеннях функції шлунка та їх клініко-біохімічна діагностика;

• порушення секреторної функції підшлункової залози, їх клініко-біохімічна характеристика при гострому та хронічному панкреатиті.

8. Види стеаторей:

   • панкреатична стеаторея (дефіцит панкреатичної ліпази при панкреатитах);

   • гепатогенна стеаторея (дефіцит жовчі в кишечнику);

   • ентерогенна стеаторея (інгібування ферментів ліполізу та ресинтезу триацилгліцеролів у кишечнику).

9. Спадкові ензимопатії недостатності дисахаридаз кишечника.

10. Клініко-біохімічна діагностика непериносимості лактози, сахарози.

Практичні роботи:

Завдання 1. Виявлення глюкози в слині методом Фелінга (якісна реакція).

Принцип методу. Реакція грунтується на здатності альдегідної груни глюкози, при нагріванні в лужному середовищі окиснюватись, відновлюючи при цьому блакитний гідроксид міді (II) Cu(OH)₂ в жовтий гідроксид міді (I) Cu(OH). При подальшому нагріванні утворюється оксид міді (I) Cu₂O цеглянисто-червоного кольору.

Реактив Фелінга, який використовують в реакції, отримують при змішуванні рівних кількостей розчину сульфату міді (розчин Фелінга 1) та лужного розчину сегнетової солі (розчин Фелінга 2). В результаті взаємодії сульфату міді з лугом утворюється гідроксид міді (II), який тут же вступає в реакцію з сегнетовою сіллю з утворенням темно-синього розчину мідно-винного комплексу (реактиву Фелінга).

Весь гідроксид міді (II) в реактиві Фелінга комплексно зв”язаний з сегнетовою сіллю, що перешкоджає утворенню з нього чорного осаду оксиду міді (II) при нагріванні.

Хід роботи. В пробірку вносять 1 мл слини, додають 10 крапель розчину Фелінга і нагрівають до кипіння. За наявності глюкози в слині випадає жовтий осад Cu(OH) або цеглянисто-червоний Cu₂O. Інтенсивність забарвлення та кількість осаду залежать від вмісту глюкози в досліджуваній пробі слини.

Завдання 2. Виявити патологічні компоненти у шлунковому соку.

1. Виявлення молочної кислоти в шлунковому соку (якісна реакція) за методом Уффельмана.

Принцип методу. Метод грунтується на взаємодії комплексної сполуки феноляту заліза фіолетового кольору з молочною кислотою з утворенням лактату заліза жотувато-зеленого кольору.

Хід роботи. 1. Приготування феноляту заліза: в колбу, що містить 10мл 1 % розчину фенолу, по краплях додають 1 % розчин хлориду заліза (III) до появи інтенсивного фіолетового забарвлення.

2. Виявлення молочної кислоти. У три пробірки, вносять по 2 мл приготованого розчину феноляту заліза і додають: в першу пробірку – 1 мл 0,5 % розчину молочної кислоти; в другу пробірку – 1 мл шлункового соку; в третю пробірку – 1 мл води. Вміст пробірок добре перемішують і спостерігають за зміною забарвлення.

3. Експрес метод. В пробірку вносять 1 мл реактиву Уффельмана (комплексна сполука феноляту заліза) і додають 10 крапель слини. Розвивається жовто-зелене забарвлення (лактат заліза).

Клініко-діагностичне значення. Молочна кислота у вмісті шлунка здорової людини не виявляється, але при ахлоргідрії, коли має місце бродіння, її можна визначити звичайними якісними пробами. Наявність молочної кислоти і збільшення органічних кислот у вмісті шлунка свідчить про бродіння вуглеводів у ньому.

2. Виявлення наявності крові у шлунковому соку бензидиновою пробою.

Принцип методу. Кров виявляється за допомогою бензидинової проби, яка ґрунтується на здатності гемоглобіну каталізувати окислення бензидину пероксидом водню з утворенням продуктів окислення синього або зеленого кольору.

Хід роботи.

До 1 мл досліджуваного (патологічного) шлункового соку додають 5 крапель 10%-го розчину бензидину в оцтовій кислоті та 3 краплі 3%-го розчину пероксиду водню. За присутності крові розвивається синє або зелене забарвлення внаслідок окислення бензидину.

За результатами проведених експериментів зробити висновки.

Завдання 3. Дослідження активності ліпази підшлункової залози.

Принцип методу: Про активність панкреатичної ліпази сулять по кількості звільнених під дією ферментів жирних кислот, які відтитровують лугом.

Хід роботи: Три пробірки заповнюють за схемою. вміст пробірок інкубують на водяній бані при 37ºС протягом 15 хв. Після інкубації проводять титрування 0,1 М розчином гідроксиду натрію в присутності фенолфталеїну. Кількість лугу в мл, що пішла на титрування (нейтралізацію) звільнених жирних кислот, є показником активності ліпази.

Завдання 4. Кількісне визначення активності амілази слини за методом Вольгемута.

Принцип методу. Метод Вольгемута грунтується на здатності амілази розщеплювати (гідролізувати) крохмаль. В ході роботи виявляють мінімальну кількість фермента, здатного повністю розщеплювати 1 мл 0,1 %-го розчину крохмалю. Цю кількість фермента приймають за одиницю амілазної активності.

Амілазна активність виражається в кількості 0,1 %-го розчину крохмалю в мілілітрах, яку може розщепити (гідролізувати) 1 мл слини при температурі 37^оС протягом 30 хв. В нормі амілазна активність слини А = 160 – 320.

Хід роботи: У сім пронумерованих пробірок вносять з бюретки по 1мл води. У 1-у пробірку додають 1мл розведеної у 10 разів слини. Вміст добре перемішують і 1мл отриманого розчину переносять з першої пробірки до другої, з неї – до третьої і т.д. Таким чином у кожній наступній пробірці вміст ферменту буде у два рази меншим, ніж у попередній. Потім в усі пробірки наливають по 2 мл 0,1% розчину крохмалю, перемішують та ставлять пробірки на водяну баню (чи у термостат) при 37С на 30 хв. Після цього пробірки виймають та охолоджують для завершення дії ферменту. В кожну пробірку додають по 2 краплі розчину йоду, добре перемішують та спостерігають за змінами кольору. Рідина у пробірках може забарвлюватися у жовтий, червоний та синій колір. Жовтий колір свідчить про повне розщеплення крохмалю. Результати спостережень вносять в таблицю, позначають синє, червоне та жовте забарвлення буквами “С”, “Ч”, “Ж”. Відмічають останню пробірку з розчином жовтого кольору та розраховують активність амілази слини:

Розрахунок. Для обчислення активності амілази необхідно знати розведення слини в останній пробірці, де відбувся повний гідроліз крохмалю.

Наприклад, остання пробірка з розчином жовтого кольору виявляється четвертою, в якій слина розведена у 160 разів. Складають пропорцію та обчисляють активність амілази:

X= = = 320 мл

1/160мл слини розщеплює 2мл 0,1 %-го розчину крохмалю;

1мл слини розщеплює х мл 0,1 %-го розчина крохмалю,

звідки X= = = 320 мл

Клініко-діагностичне значення. Метод Вольгемута широко використовується в клінічній практиці для визначення амілазної активності крові та сечі. Зростання активності амілази (внаслідок збільшення кількості) в сироватці крові буде мати діагностичне значення для підтвердження наявності запалення підшлункової залози - панкреатиту. Внаслідок розвитку панкреатиту, при пошкодженні панкреацитів підвищується секреція панкреатичного соку, передчасне виділення та активація ферментів безпосередньо в протоках і клітинах залози. Внаслідок цього в кров попадають ферменти підшлункової залози, такі як трипсин і амілаза, активність якої в сироватці крові значно зростає.

Завдання 5. Виявлення індикану в сечі (проба Обермейєра).

Принцип методу. Перетворення індикану в індоксил після гідролізу ефірного зв’язку сильною мінеральною кислотою (сірчаною) та наступне окислення індоксилу трихлороцтовим залізом з утворенням забарвленої сполуки.

Хід роботи. До 4 мл сечі додають 0,4 мл ацетату свинця ([CH₃COOH]₂Pb) для осадження жовчних пігментів, солей та інших речовин, які заважають реакції. Фільтрують, 1-2 мл фільтрату змішують з рівним об’ємом реактиву Обермейєра, додають 1-2 мл хлороформу й обережно перемішують. Після того, як нижній шар хлороформу забарвлюється в синій або червоний колір, його відбирають та переносять в іншу пробірку і додають декілька крапель тіосульфату натрію.

В нормі, за відсутності індикану, реакція негативна (тобто після додавання тіосульфату натрію забарвлення зникає).

У випадку позитивної реакції після додавання тіосульфату забарвлення не зникає.

Клініко-діагностичне значення. Індикан – калієва або натрієва сіль індоксилсірчаної кислоти. міститься в нормальній сечі у вигляді слідів, які неможуть бути виявлені звичайними методами дослідження. Велика кільксть індикану з’являється в сечі при посиленні процесів гниття білків у кишечнику внаслідок великої кількості бактерій, що спричиняють гниття у кишечнику, при запорах та заворотах кишечника, при поганому перетравленні білків у кишечнику.

Література:

Основна:

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія.–Київ-Тернопіль:Укрмедкнига,2000.–508с.

2. Будова та властивості білків, ферментів, вітамінів і гормонів. Методичні розробки практичних занять з біологічної хімії. За ред. Ю.В.Хмелевського. – Київ: НМУ. – 1992. – 31 с.

3. Обмін речовин та його показники. Методичні розробки практичних занять з біологічної хімії. Під ред. Ю.В.Хмелевського.– Київ: НМУ.– 1992. – 37 с.

Додаткова:

4. Гонський Я.І. Біохімія людини.- Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – 744 с.

5. Кольман Я., Рем К. Наглядная биохимия. –Москва: Мир, 2004.– 470 с.

Тема заняття № 2. Дослідження функціональної ролі водорозчинних (коферментних) та жиророзчинних вітамінів у метаболізмі та реалізації клітинних функцій.

Цілі заняття:

• Трактувати біохімічні закономірності функціонування вітамінів як компонентів харчування людини та регуляторів ферментативних реакцій і обмінних процесів.

• Трактувати функції водорозчинних коферментних вітамінів В₁, В₂, РР, В₆, В₁₂, Н, С, Р.

• Пояснювати біорегуляторні (гормоноподібні) та антиоксидантні функції жиророзчинних вітамінів А, Е, К, F, D.

• Аналізувати причини та молекулярно-біохімічні механізми виникнення патологій при гіпо- гіпервітамінозах.

Теоретичні питання:

1. Загальна характеристика вітамінів як компонентів харчу­­­вання людини.

2. Водорозчинні коферментні вітаміни (В₁, В₂, РР, В₆, В₁₂, Н, фолієва кислота, пантотенова кислота, вітаміни С, Р):

• структура біологічно активних форм;

• біохімічні функції та роль в обміні речовин;

• прояви недостатності та гіперві­­­тамінозу;

• джерела та добова потреба.

3. Жиророзчинні вітаміни(А, Е, К, F, D):

• біологічні влас­­­тивості та роль в обміні речовин;

• прояви недостатності та гіперві­­­тамінозу;

• джерела та добова потреба.

4. Біоантиоксидантні властивості коферментних та жиророзчинних вітамінів.

5. Хвороби ві­­­тамінної недостатності:

• екзогенні гіпо- та авітамінози;

• ендогенні гіпо- та авітамінози;

• клініко-біохімічні аспекти авітамінозів.

6. Використання вітамінних препаратів у профілактиці та лікуванні захворювань.

7. Вітамінні харчові добавки, профілактичні та лікувальні аспекти застосування.

Практичні роботи

Завдання 1. Виявлення та визначення вмісту водорозчинних вітамінів.

Робота 1. Визначення вітаміну С (аскорбінової кислоти) в сечі.

Для оцінки С-вітамінної забезпеченості організму найбільше поширення отримали прямі методи визначення аскорбінової кислоти в крові і сечі. Концентрація вітаміну в плазмі крові і виведення його з сечею знаходяться в тісному зв’язку і є показником забезпеченості харчового раціону вітаміном С.

Принцип методу. Аскорбінова кислота в кислому середовищі відновлює молекулярний йод. Поява синього забарвлення вказує на те, що вся аскорбінова кислота з відновленої форми перейшла в окислену, і перша надлишкова крапля розчину йоду в присутності крохмалю дає синє забарвлення.

Хід роботи. В колбу відміряють 5 мл сечі і додають 5 крапель розчину крохмалю. Титрують розчином йоду до появи синього забарвлення, що не зникає протягом 30 сек. Враховуючи, що 1 мл розчину йоду відповідає 1 мкмоль аскорбінової кислоти, обчислюють виділення аскорбінової кислоти за добу за формулою:

Х = а  1  1500 / 5

де: а-кількість мл розчину йоду, що пішла на титрування; 1500 – добовий діурез; 5 – об’єм сечі в пробі; Х – вміст аскорбінової кислоти в добовій кількості сечі.

В нормі за добу з сечею виділяється 284-568 мкмоль аскорбінової кислоти.

Робота 2. Визначення вмісту аскорбінової кислоти в плазмі крові.

Принцип методу. Кількісне визначення вітаміну С грунтується на його здатності легко вступати у окисно-відновні реакції і відновлювати такі сполуки, як 2,6-дихлорфеноліндофенол (ДХФІФ). Розчин 2,6-ДХФІФ в нейтральному середовищі має синє забарвлення. Поки в розчині є аскорбінова кислота, 2,6-ДХФІФ відновлюється і при цьому знебарвлюється. Після окислення ним всієї аскорбінової кислоти надлишок реактиву забарвлює розчин в кислому середовищі в слабо рожевий колір.

Хід роботи. 1 мл робочого розчину (який містить одну частину плазми крові, одну частину бідистиляту та дві частини 5% розчину метафосфорної кислоти) титрують розчином 2,6-ДХФІФ з мікробюретки до появи рожевого забарвлення. Після чого титрування припиняють і відмічають кількість розчину 2,6-ДХФІФ, що пішла на титрування.

Розрахунок проводять за формулою:

Х = а  0,045  1000 / 1

де: а-кількість мл розчину 2,6-ДХФІФ, що пішла на титрування; 1000 – розрахунок на 1 л; 0,045 – кількість мкмоль аскорбінової кислоти, що відповідає титру розчину 2,6-ДХФІФ; Х – вміст аскорбінової кислоти в плазмі крові; 1 – кількість мл плазми, взятої для аналізу.

В нормі в плазмі крові міститься 34,1-90,9 мкмоль/л аскорбінової кислоти.

Клініко-діагностичне і практичне значення. Вітамін С (аскорбінова кислота) є необхідним харчовим фактором в організмі людини. Аскорбінова кислота бере участь в окислювально-відновних реакціях, синтезі стероїдних гормонів у корі наднирників і катехоламінів у мозковому шарі наднирників, у процесах гідроксилювання й посттрансляційної модифікації колагену, в утворенні тетрагірофолату з фолієвої кислоти; прискорює всмоктування заліза, активує пепсиноген. При нестачі вітаміну С організм втрачає здатність депонувати міжклітинні "цементуючі" речовини, що викликає ураження судинних стінок і опорних тканин.

Завдання 2. Виявлення жиророзчинних вітамінів.

Робота 1. Виявлення вітаміну А. Реакція Друммонда.

Принцип методу. Сірчана кислота (H₂SO₄), яка має водовіднімаючі (дегідратаційні) властивості, сприяє перетворенню вітаміну A – ретинолу в забарвлений комплекс фіолетово-червоного кольору.

Хід роботи. На сухе предметне скло наносять 2 краплі риб’ячого жиру в хлороформі і 1 краплю концентрованої сірчаної кислоти (H₂SO₄). Спостерігають за появою забарвлення.

Клініко-діагностичне й практичне значення. Вітамін А впливає на бар'єрну функцію шкіри, слизових оболонок, на проникність клітинних мембран і біосинтез їхніх компонентів, зокрема глікопротеїнів; бере участь в окислювально-відновних реакціях, оскільки здатний утворювати перекиси, які у свою чергу підвищують швидкість окислювання інших сполук.

При недостатності вітаміну А в людини з'являються симптоми гальмування росту, виснаження організму, специфічні ураження шкіри, слизових оболонок й очей. У першу чергу пошкоджується епітелій шкіри, що супроводжується його патологічним ороговінням. Наслідком цього порушення є поява вторинних гнійних і гнилісних процесів слизових оболонок усього шлунково-кишкового тракту, сечостатевої й дихальної системи. Специфічним для А-авітамінозу є ксерофтальмія - ураження очного яблука внаслідок закупорки сльозного каналу, епітелій якого також піддається ороговінню.

Робота 2. Виявлення вітаміну D. Анілінова проба.

Принцип методу. Вітамін D при взаємодії з аніліновим реактивом при нагріванні забарвлюється в червоний колір.

Хід роботи. В суху пробірку вносять 3-5 крапель риб’ячого жиру і 5 крапель хлороформу, перемішують та додають 1 мл суміші аніліну та концентрованої соляної кислоти (HCl) (15:1). При нагріванні жовта емульсія набуває червоного забарвлення. Через 1-2 хв. емульсія розділяється на два шари, з яких нижній забарвлений в інтенсивний червоний колір.

Клініко-діагностичне й практичне значення. Активна форма вітаміну D - 1,25-дигідроксикальциферол підтримує постійний рівень кальцію й фосфору в крові. Вітамін D стимулює всмоктування кальцію й фосфору в кишечнику, сприяє посиленню тканинного дихання й окисного фосфорилювання, а також окисленню вуглеводів до лимонної кислоти; стимулює мобілізацію кальцію з кісткової тканини.

Нестача вітаміну D у раціоні дітей приводить до розвитку рахіту - захворювання, в основі якого лежать зміни обміну фосфору й кальцію, порушення відкладення їхніх солей на колагенову основу кісток, які ростуть. В результаті розвивається остеомаляція - розм'якшення кісток. Для D-авітамінозу дорослих характерним є розвиток остеопорозу внаслідок вимивання солей кальцію й фосфору, кістки стають крихкими й це часто призводить до переломів.

Робота 3. Виявлення вітаміну Е. Реакція з азотною кислотою (HNO₃).

Принцип методу. Оскільки продукт окислення токоферолу має хіноїдну структуру, то при взаємодії спиртового розчину токоферолу з концентрованою азотною кислотою (HNO₃) реакційна суміш забарвлюється в червоний колір. Цю реакцію використовують для кількісного визначення вітаміну.

Хід роботи. В пробірку вносять 5 крапель 0,1% розчину α-токоферолу (вітаміну Е), додають декілька кришталиків сахарози і 10 крапель концентрованої азотної кислоти (HNO₃). Перемішують скляною паличкою. Утворюється емульсія, яка поступово забарвлюється в червоний колір.

Клініко-діагностичне й практичне значення. Вітамін Е (токоферол) є потужним і основним антиоксидантом. Його дія спрямована на посилення тканинного дихання і підтримання на постійному рівні вільно-радикального пероксидного окислення. Опосередковано як кофактор вітамін Е бере участь у транспорті електронів і протонів у дихальному ланцюзі, стимулює синтез убіхінону.

Токоферол служить "пасткою" для вільних радикалів - утворює із ними неактивні форми, які обривають вільно-радикальний ланцюг. Цим вітамін Е захищає від пероксидного окислення поліненасичені жирні кислоти в складі клітинних мембран. Гіповітаміноз супроводжується патологією мембран у вигляді пероксидного гемолізу еритроцитів, розсмоктування плоду під час вагітності, м'язової дистрофії, некрозу печінки, розм'якшення мозку, атрофії сім’янників, що приводить до безплідності.

Робота 4. Виявлення вітаміну К. Реакція з лужним розчином цистеїну.

Принцип методу. При наявності цистеїну вікасол (вітамін К) в лужному середовищі забарвлюється в лимонно-жовтий колір.

Хід роботи. У пробірку вносять по 5 крапель розчинів вікасолу та цистеїну і 5 мл 10% розчину їдкого натру (NaOH). Спостерігають за появою лимонно-жовтого забарвлення.

Клініко-діагностичне й практичне значення. Цей вітамін є антигеморагічним фактором і має пряме відношення до згортання крові. Роль вітаміну К у згортанні крові зумовлена його участю в утворенні протромбіну, який є неактивним попередником ферменту тромбіну, що перетворює білок плазми крові фібриноген у фібрин. Фібрин є нерозчинним волокнистим білком, що приймає участь в утворенні кров’яного згустка. Для того, щоб протромбін міг активуватися і перетворитися на тромбін, він спершу повинен зв’язати іони Са²⁺. Нормальна молекула протромбіну містить декілька залишків особливої амінокислоти - -карбоксиглутамінової кислоти, яка й зв’язує іони Са²⁺. При нестачі вітаміну К місце залишків -карбоксиглутамінової кислоти займають залишки звичайної глутамінової кислоти. Відтак, порушується каскад згортання крові і, як наслідок, підвищується кровотеча.

Література:

Основна:

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія.– Київ – Тернопіль: Укрмедкнига, 2000.– 508с.

2. Будова та властивості білків, ферментів, вітамінів і гормонів. Методичні розробки практичних занять з біологічної хімії. За ред. Ю.В.Хмелевського. – Київ: НМУ. – 1992. – 31 с.

Додаткова:

3. Гонський Я.І. Біохімія людини.- Тернопіль: Укрмедкнига, 2002.– 744 с.

4. Вороніна Л.М. Біологічна хімія. – Харків: Вид-во НФАУ, 2000. – 600 с.

5. Практикум з біологічної хімії. Під ред. О.Я.Склярова.- Київ: Здоров’я. –2002. –298 с.

Змістовий модуль 17. Біохімія та патобіохімія крові.

Тема заняття № 3. Дослідження фізіологічних та біохімічних функцій крові: буферні системи, кислотно-основний стан. Патологічні форми гемоглобінів.

Цілі заняття:

• Пояснювати значення фізіологічних і біохімічних функцій крові.

• Пояснювати механізм участі гемоглобіну в транспорті кисню і діоксиду вуглецю в легеневих капілярах і капілярах периферичних тканин.

• Класифікувати молекулярні форми гемоглобінів в еритроцитах здорової людини і пояснювати виникнення патологічних форм гемоглобінів, їх оцінка в діагностиці патологічних станів.

• Використовувати результати біохімічного аналізу крові (норма і патологія) для оцінки стану здоров’я людини, механізму регуляції та підтримки кислотно-основного стану.

• Трактувати норму та молекулярно-біохімічні механізми виникнення патологічних форм гемоглобінів та зміну основних біохімічних показників біохімії крові для діагностики функціонального стану організму людини .

Теоретичні питання

1. Кров- внутрішнє середовище організму. Роль крові в підтриманні гомеостазу.

• Склад крові, плазми, сироватки крові. Фізико-хімічні і біологічні властивості крові.

• Об’єм крові, рН крові. Форменні елементи крові: еритроцити, лейкоцити, тромбоцити. Норма і патологія.

2. Гемоглобін, його структура, властивості, види.

3. Патологічні стани гемоглобіну: гемоглобінопатії і таласемії.

4. Дихальна функція еритроцитів в легеневих капілярах та тканинах.

• Ефект Бора.

• Залежність ступеня оксигенації від парціального тиску кисню.

S-подібна кінетика дисоціації оксигемоглобіну.

5. Кислотно-основний стан. Регуляція рН рідин в організмі:

• порушення кислотно-основного стану: ацидоз метаболічний (кетоацидоз, лактат ацидоз, гломерулярний ацидоз) та респіраторний; алкалоз (метаболічний та респіраторний). Причини їх виникнення.

• Роль нирок, органів дихання, тканин в регуляції кислотно-основного стану.

6. Буферні системи крові, їх види:

• роль буферних систем крові в підтриманні постійності рН крові;

• функції гідрокарбонатної, фосфатної, гемоглобінової та білкової буферних систем в організмі людини.

• системи транспорту СО₂ з тканин до легень.

7. Основні типи гіпоксії, механізм їх виникнення, прийоми лабораторної діагностики:

• гіпоксія викликана зниженням рО₂ в повітрі, що вдихається (екзогенна гіпоксія);

• гіпоксія викликана порушенням постачання тканин киснем внаслідок розвитку патологічного процесу ( легеневий тип, серцево-судинний, тканинний і немічний).

8. Роль системи ренін-ангіотензин в регуляції осмотичного тиску.

9. Гормони – регулятори осмотичного тиску крові.

10. Зміст понять: ”Загальний аналіз” крові і „біохімія” крові. Залежність біохімічних показників крові від метаболічних процесів в організмі.

Практичні роботи

Завдання 1. Визначення гемінової групи гемоглобіну бензидиновою пробою

Принцип методу. Для визначення гемінової групи використовують бензидинову пробу, яка базується на каталітичних властивостях похідних гемоглобіну( оксигемоглобіну, карбоксигемоглобіну ).Продукт окислення бензидину має синій колір, який поступово може переходити в червоний. Проба дуже чутлива.

Хід роботи. В пробірку вносять 5 крапель розбавленої крові, додають 5 крапель розчину бензидину і 2-3 краплі перекису водню. Спостерігають за зміною кольору.

Клініко -дігностичне значення. Концентрація гемоглобіну в крові у жінок становить 120-140 г/л, у чоловіків- 130-140г/л. Зменшення концентрації гемоглобіну є основним лабораторним симптомом анемії.Зниження рівня гемоглобіну в крові залежить від форми анемії.

Завдання 2. Біуретовий метод на кількісне визначення білків у плазмі крові.

Принцип методу. Пептидні групи здатні утворювати з солями міді в лужному середовищі комплекс, який має фіолетовий колір.Біуретова реакція служить доказом наявності речовин, у яких існує не менше двох пептидних зв’язків.

Хід роботи. У першу пробірку вміщують 0,1мл 0,9% розчину хлориду натрію (контроль), у другу-0,1мл стандартного розчину білка (50г/л), у третю, четверту і п’яту - по 0.1мл дослідного розчину білка (задачі). В усі пробірки вливають по 5мл біуретового реактиву. Перемішують і через 30 хв визначають екстинкцію (оптичну густину) за допомогою ФЕК у кюветах на 10мм при червоному світлофільтрі (750нм) проти контрольного розчину. Розрахунок проводять за формулою:

Х=( А*В)/С ,

де Х- концентрація речовин у дослідній пробі, г/л; А-концентрація речовин у стандартному розчині; В- екстинкція дослідного розчину; С-екстинкція стандартного розчину білка.

Клініко-діагностичне значення.У здорової людини вміст білків в крові становить від 60 до 80 г/л. Менше 60г/л- гіпопротеїнемія: ентерит, хронічний панкреатит, опіки , хронічні захворювання нирок, масивні кровотечі, голодування, затримка солей і води. Більше 80г/л- гіперпротеїнемія: ревматоїдний артрит, дифузні захворювання сполучної тканини (колагенози, бронхоектаз, цироз печінки), діарея, цукровий діабет.

У здорової людини практично не виділяється білок із сечею.

Завдання 3. Колоїдна проба Вельтмана на визначення стану білків крові.

Принцип методу. Білки- це колоїдні розчини, які зв’язують воду, не дозволяючи їй виходити із кров’яного русла. При взаємодії їх з осаджуючими речовинами відбувається зміна їх властивостей.

Хід роботи. До 0,1мл плазми крові додають 4,9мл дистильованої води, змішують і сюди ж добавляють 0,1мл 0,5% розчину хлориду кальцію. Нагрівають. Охолоджують, спостерігаючи за появою осаду. Результати оцінюють за загальною кількістю кальцію в цій реакції. Норма -0,4-0,5мл.

Клініко-діагностичне значення. Проба Вельтмана використовується в діагностиці при захворюванні печінки, ревматизмі, туберкульозі легень.

Завдання 4. Якісне визначення кальцію, магнію, фосфору в плазмі крові.

Хід роботи. Іони кальцію визначають додавши до 1мл плазми крові 3-4 краплі насиченого розчину оксалату амонію - випадає осад. Іони магнію- до одержаного фільтрату від досліду першого додають 3-4 краплі концентрованого розчину аміаку- утворюється осад. Фосфорну кислоту визначають молібдатом амонію і аскорбіновою кислотою. Інтенсивність голубого кольору прямо пропорційна концентрації фосфору в плазмі крові

Норма кальцію 2,1-2,55 ммоль/л, магнію -0,82-0,94 ммоль/л, фосфору-0,87-1,45ммоль/л ( в сироватці).

Література

Основна:

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія.-Київ-Тернополь: Укрмед-книга, 2000. – 508 с.

2. Хмелевский Ю.В., Губский Ю.И., Зайцева С.Д. и др.Биологическая химия.Практикум. – К.: Вища шк., 1985- 212 с.

3. Обмін речовин та його показники. Методичні розробки практичних занять з біологічної хімії.-Київ: НМУ.-1992-.37с.

Додаткова:

4. Бишевський А.Ш., Терсенов О.А., Біохімія для лікаря - Київ, Український Центр духовної культури, 2001.-395с.

Тема заняття № 4. Дослідження білків плазми крові: білки гострої фази запалення, індикаторні ферменти, ліпопротеїни.

Цілі заняття:

• Пояснювати основні функції білків плазми крові на основі їх фізико-хімічних властивостей.

• Пояснювати діагностичне значення зростання вмісту білків „гострої фази” запальних процесів.

• Пояснювати молекулярно-біохімічні механізми змін вмісту в плазмі крові секреторних і тканинних ферментів, атерогенних і антиатерогенних ліпопротеїнів.

• Пояснювати біохімічні основи функціонування систем регуляції тиску крові (калікреїн-кінінова та ренін-ангіотензивна системи) та науково-обгрунтоване застосування гіпотензивних лікарських засобів- інгібіторів ангіотензин перетворюючого ферменту.

Теоретичні питання

1. Основні групи білків плазми крові; їх склад та вміст в нормі і при патології.

2. Фактори, що впливають на вміст білків у плазмі крові: гіпер- та гіпо-протеїнемії.

3. Білки гострої фази запалення: С-реактивний білок, церулоплазмін, гаптоглобін, кріоглобулін, α1 - Антитрипсин, α2 -Макроглобулін, інтерферон. Їх діагностичне значення.

4. Ферменти плазми крові: власні (секреторні) та індикаторні( тканинні) ферменти.

5. Діагностичне значення дослідженя активності ферментів та ізоферментів плазми крові: креатинфосфокінази, ЛДГ, АсТ, АлТ, амілази, ліпази

6. Калікреїн-кінінова система, її біологічна роль.

7. Ліпопротеїни плазми крові:

   • класифікація: ХМ, ЛПДНЩ, ЛППЩ, ЛПНЩ, ЛПВЩ.

• схема будови ліпопротеїнів;

• метаболізм та функціональне значення окремих класів ліпопротеїнів плазми крові.

• Гіпер- і, їх види, прояви. Гіперліпопротеїнемія та атеросклероз.

• Молекулярно-біохімічні механізми атеросклерозу.

8. Гіперліпопротеїнемія та гіперхолестеринемія – загроза розвитку атеросклерозу

9. Роль глутатіону в захисті від пероксидного окисленні ліпідів, вітаміни антиоксиданти.

10. Залишковий азот плазми крові.

Практичні роботи

Завдання 1. Фракціонування білків плазми крові методом висолювання: визначення альбумінів і глобулінів плазми крові.

Принцип методу. Білки, в залежності від величини заряду і молекулярної ваги, з водного розчину осаджуються мінеральними, органічними кислотами та розчинами солей різної концентрації.

Хід роботи. В пробірку вносять 2мл плазми крові, добавляють 2мл 50% розчину сульфату амонію. Випадає осад -це глобуліни. У фільтраті залишились альбуміни,які осаджуються 100% насиченим розчином сульфату амонію.

Клініко-діагностичне значення. Осадження білків застосовують для виділення білків із тканин, виявлення їх у різних біологічних рідинах, розділення суміші білків.

Завдання 3. Визначенн типів ліпопротеїнів по вмісту в них холестерину.

Принцип методу. Співвідношення і вміст ліпопротеїнів може мінятися при патологічних станах, що дозволяє використовувати результати кількісного визначення ліпопротеїнів в діагностиці; при взаємодії з концентрованою сірчаною кислотою утворюється різної сили червоний колір( ліпопротеїни мають різний вміст холестерину, який і дає відтінки кольору).

Хід роботи. В пробірки №1 і №2 наливають по 5 крапель плазми крові потім добавляють 5 крапель концентрованої сірчаної кислоти і спостерігають за зміною кольору.

Клініко-діагностичне значення. Норма в крові 3-7 ммоль/г загального холестерину. Збільшення його пов’язане з віком, з розвитком різних хвороб: ІХС, інфаркт міокарда, хвороби печінки, цукровий діабет.

Гіпохолестеринемія - зниження рівня холестерину, характерне при захворюванні ЦНС, гіпотиреозі, гострому реатиті, гострих інфекційних хворобах, ревматизмі, гемолітичній жовтяниці.

Література

Основна:

1. Губський Ю.І. ,Біологічна хімія. - Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000-508с.

2. Обмін речовин та його показники. Методичні розробки практичних занять з біологічної хімії. За редакцією Ю.В.Хмелевского.—Київ: НМУ.-1992.-37с.

3. Хмелєвський Ю.В.-„Биологическая химия.Практикум”-Київ: Вища школа.-1985.-207с.

Додаткова

4. Практикум з біологічної хімії.За редакцією О. Я. Склярова – Київ: Здоров’я – 2002 - 298с.

5. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. - Біохімія людини.- Тернопіль. Укрмедкнига. – 2002 - 744с.

6. Бишевський А.Ш.,Терсенов О.А.-Біохімія для лікаря-Київ:Український Центр духовної культури.- 2001.-395с.

Змістовий модуль 18. Функціональна та клінічна біохімія органів і тканин

Тема заняття № 8. Дослідження біохімічних функцій печінки та обміну жовчних пігментів. Патобіохімія жовтяниць.

Цілі заняття:

• Трактувати біохімічні закономірності функцій печінки: вуглеводної, ліпід-регулюючої, білок-синтезуючої, сечовино-утворювальної, пігментної, жовчо-утворювальної, детоксикаційної;

• Аналізувати стан здоров’я людини на підставі змін біохімічних параметрів проміжних та кінцевих продуктів обміну небілкових азотовмісних компонентів крові.

• Аналізувати причини та молекулярно-біохімічні механізми виникнення жовтяниць.

• Аналізувати диференційні зміни біохімічних показників крові та сечі (вільний та кон’югований білірубін) з метою оцінки патобіохімії жовтяниць;

• Пояснювати причини виникнення основних патологічних станів і порушень функції печінки, роль індикаторних ферментів у виявленні цих порушень. Коефіцієнт Де Рітіса.

Теоретичні питання

1. Біохімічні функції печінки в організмі:

• вуглеводна (глікогенна) функція печінки;

• функція регуляції ліпідного складу крові;

• білок синтезуюча функція печінки;

• сечовино-утворювальна функція печінки;

• жовчо-утворювальна та пігментна функції печінки;

• детоксикацій на функція печінки.

2. Катаболізм гемоглобіну та його простетичної групи – гему:

   • розрив тетрапірольного кільця з утворенням вердоглобіну;

   • розпад вердоглобіну до білівердину;

   • перетворення білівердину на білірубін;

   • транспорт білірубіну з клітин ретикуло-ендотеліальної системи в печінку;

   • утворення глюкуронід білірубіну;

   • біотрансформація білірубін-глюкуронідів в кишечнику;

   • рециркуляція продуктів біотрансформації.

3. Патобіохімія жовтяниць:

• передпечінкова (гемолітична) жовтяниця;

• печінкова (паренхіматозна) жовтяниця;

• після печінкова (обтураційна) жовтяниця;

• ферментативні (спадкові) жовтяниці.

4. Клініко-біохімічна характеристика жовтяниць за показниками: вільний (непрямий) білірубін, кон’югований (прямий) білірубін, білірубін сечі, уробіліноген сечі, стеркобілін калу.

5. Біохімічні лабораторні показники, що використовуються у діагностиці печінкових захворювань: активність АлТ, АСТ та глутаматдегідрогенази, вміст загального, вільного та кон’югованого білірубіну, функціональні проби.

Практичні роботи

Завдання 1. Визначення білірубіну в плазмі крові за методом Бокальчука.

Принцип методу. Шляхом розведення сироватки знаходять найменшу кількість білірубіну, здатного давати забарвлення з діазореактивом (0,16 мг білірубіну). Враховуючи розведення сироватки, обчислюють вміст білірубіну.

Хід роботи. Беруть 8 пробірок. В одну наливають 1мл сироватки, а в інші- по 0,5мл фізіологічного розчину. З першої пробірки 0,5мл сироватки переносять у другу і перемішують. З другої беруть 0,5млі переносять у третю і так далі. З останньої пробірки 0,5мл виливають геть. До всіх додають по 0,5мл діазореактиву та по 0,5мл спирту і струшують. Відмічають останню пробірку , в якій є рожеве забарвлення -білірубіну в ній 0,16мг. Це число помножують на номер останньої пробірки з рожевим забарвленням і одержують вміст білірубіну в мг/100мл. Коефіцієнт перерахунку в одиницях СІ 17,104 мкмоль/л.

У нормі загальний білірубін 0,5-1,2 мг/дл, або 1,7-20,5 мкмоль/л.

Завдання 2. Визначення жовчних пігментів в сечі реакцією Гмеліна.

Принцип методу заснований на окисленні жовчних пігментів концентрованою азотною кислотою і появі різно забарвлених продуктів окислення ( проби не струшувати).

Клініко-діагностичне значення. Жовчні пігменти-білірубін, білівердин, уробілін –з’являються лише при патології. Білірубінурію спостерігають при ураженнях печінки і жовчовивідних шляхів (хвороба Боткіна, механічна жовтяниця).Сеча за наявністю жовчних пігментів набуває темного жовто-зеленого кольору.

Завдання 3. Визначення уробіліну в сечі (за методом Флоранса і Богомолова).

Принцип методу. Уробілін здатний утворювати з сульфатом міді сполуку ,яка має рожево-червоний або мідно-червоний колір і добре екстрагується хлороформом.

Хід роботи. В пробірки з 2-3мл сечі додають по 2-3 краплі насиченого розчину сульфату міді і по 0,5мл хлороформу. Енергійно струшують. У присутності уробіліну хлороформ забарвлюється у рожевий колір (внизу пробірки).

Клініко-діагностичне значення. Уробілінурію спостерігають при паренхіматозних захворюваннях печінки( гепатити, цироз, отруєння), гемолітичних станах, кишкових захворюваннях (ентероколіт,закреп).

Література

Основна:

1. Губський Ю.І.-Біологічна хімія–Київ-Тернопіль: Укрмедкнига,2000-508с.

2. Хмелєвський Ю.В. Биологическая химия. Практикум,-Київ:Вища школа.-1985-207с.

3. Обмін речовин та його показники. Методичні розробки практичних занять з біологічної хімії. За редакцією Ю.В.Хмелевського-Київ: КНУ.-1992-37с.

Додаткова

4. Практикум з біологічної хімії.За редакцією О.Я.Склярова-Київ: Здоров’я -2002-298с.

5. Бишевський А.Ш., Терсенов О.А. Біохімія для лікаря-Київ: Український Центр духовної культури.-2001-395с.

Тема заняття № 14. Дослідження небілкових азотовмісних компонентів крові – кінцевих продуктів азотистого обміну: сечовини, сечової кислоти, креатину, креатиніну, амінокислот.

Цілі заняття:

• Аналізувати біохімічні процеси утворення кінцевих продуктів обміну речовин – сечовини, сечової кислоти, креатину, креатині ну.

• Пояснювати причини утворення аміаку в головному мозку і в тканинах організму людини та механізми його знешкодження.

• Пояснювати виникнення основних патологічних станів, які пов’язані з порушенням азотистого обміну і обміну окремих амінокислот.

• Використовувати результати біохімічного аналізу для оцінки стану певних ланок обміну амінокислот і стану здоров’я людини в цілому.

Теоретичні питання.

1. Загальний азот плазми крові: білковий та небілковий (залишковий або резидуальний) азот. Види азотемії:

• абсолютна – ретенційна, продукційна;

• відносна.

2. Сечовина – кінцевий продукт обміну білків та амінокислот:

• шляхи утворення аміаку в організмі людини, його токсичність, транспортні форми і механізми знешкодження; гіперамоніємія;

• ферментативні реакції біосинтезу сечовини;

• вміст сечовини в крові в нормі, коефіцієнт азоту сечовини, добове виведення сечовини з організму;

• генетичні дефекти ферментів синтезу сечовини.

3. Амінокислоти плазми крові.

4. Сечова кислота – кінцевий продукт катаболізму пуринових основ:

• схема катаболізму пуринових нуклеотидів;

• вміст сечової кислоти в крові в нормі та добове її виведення;

• порушення обміну сечової кислоти – гіперурикемії: первинні (спадкові) – подагра, хвороба Леша-Ніхана і вторинні (набуті)- захворювання крові, нирок, отруєння свинцем.

5. Креатин та кінцевий продукт його обміну – креатинін.

• біосинтез креатину та креатиніну;

• фізіологічне значення креатину в енергозабезпеченні функції м’язів;

• креатинін – форма виведення азоту амінокислот з організму;

• вміст в крові в нормі та добове виведення креатині ну.

6. Глутатіон - -глутамініл-цистеїніл-гліцин:

• біосинтез глутатіону;

• біологічні функції глутатіону.

7. Індикан – кінцевий продукт катаболізму триптофану.

8. Діагностичне значення визначення кінцевих продуктів обміну речовин.

9. Біохімічні показники небілкових азотовмісних компонентів цільної крові та плазми крові: сечовини, сечової кислоти, креатину, креатиніну, азоту амінокислот, індикану.

10. Безазотисті органічні компоненти крові: глюкоза, органічні кислоти, кетонові тіла, вітаміни їх біологічна роль.

11. Неорганічні компоненти плазми крові.

Практичні роботи

Завдання 1. Визначення вмісту залишкового азоту крові методом Боданського.

Принцип методу. Вміст залишкового азоту крові визначають у безбілковому фільтраті після осадження білків крові -дією концентрованої сульфатної кислоти. При цьому азот усіх азотовмісних сполук у вигляді аміаку зв’язується із сульфатною кислотою, утворюючи сульфат амонію, який в свою чергу з реактивом Несслера утворює сполуку жовто-оранжевого кольору. Інтенсивність забарвлення прямо пропорційна концентрації азоту.

Хід роботи. У пробірку наливають 0,5мл безбілкового фільтрату і 0,05мл концентрованої сульфатної кислоти. Спалюють на піщаній бані до утворення бурого забарвлення. Пробірку охолоджують, додають 2 краплі пергідролю і знову спалюють до знебарвлення. Після охолодження в пробірку додають 10мл свіжої кип’яченої води (дистильованої) і нейтралізують 12,5М розчином їдкого натрію до слабо лужної реакції. Реакцію визначають за зміною кольору лакмусового папірця (з червоного на синій).Потім додають 0,5мл реактиву Несслера( калій-меркурію йодид). Вміст пробірки забарвлюється у жовтий колір різної інтенсивності залежно від вмісту азоту.

Паралельно з дослідною пробою обробляють стандартну: 0,2мл стандартного розчину, 0,05мл сульфатної кислоти, 0,3мл 12,5 М розчину їдкого натру, 0.5мл реактиву Несслера і 9,8 мл дистильованої води. Дослідну і стандартну проби вимірюють порівняно з контролем на реактиви за довжини хвилі 440-450 нм у кюветі завтовшки 5мм. У контролі замість сульфату амонію вода і жовтуватий колір розчину .Розрахунки здійснюють за формулою:

Сд=Сст*(Ед/Ест)=21,42 Ед/Ест,

де Сд- концентрація залишкового азоту в досліді, ммоль/л;

Ед -екстинкція дослідної проби; Ест- екстинкція стандартної проби; Сст-концентрація залишкового азоту в стандарті=21,42 ммоль/л,.Норма залишкового азоту в крові становить 14,3-25 ммоль/л (20-35 мг%).

Клініко-діагностичне значення:

1.Діагностика порушень видільної функції нирок і оцінки ступеня ниркової недостатності. Ретенційна ( ниркова) азотемія зустрічається при гломерулонефритах, пієлонефриті, туберкульозі нирок. Продукційну азотемію спостерігають при кахексії, лейкозі , новоутвореннях, кишковій непрохідності.

2.Оцінка сечовиноутворювальної функції печінки і виявлення печінкової недостатності.

Завдання 2. Мурексидна проба на сечову кислоту.

Принцип методу. Сечова кислота за присутністю концентрованої нітратної кислоти утворює з аміаком пурпурно-червону речовину- мурексид амонієву сіль пурпурової кислоти.

Хід роботи. До порошку сечової кислоти додають 1-2 краплі нітратної кислоти і обережно нагрівають(70*С).Після охолодження до коричнево-червоного залишку, який містить продукти окислення і гідратації сечової кислоти, додають краплю розчину аміаку- появляється пурпурно-червоне забарвлення.

Клініко-діагностичне значення. Мурексидною пробою користуються для виявлення сечової кислоти у сечовому камені.

Завдання 3. Визначення аміаку в добовій сечі.

Принцип методу. При взаємодії формаліну з амонійними солями утворюється уротропін та соляна кислота, кількість якої еквівалентна вмісту амонійних солей у сечі.

Хід роботи.В колбу налити 10мл сечі, додати 1-2 краплі фенолфталеїну( нейтралізувати кислі продукти), додати 5мл нейтрального розчину формаліну. Титрування проводять 0.1М розчином лугу до появи рожевого забарвлення. Розрахунок робим за формулою:

Х =а* 0,0017*1300/В,

де Х- вміст аміаку у г., а- кількість 0,1М( моль/л) лугу, що пішло на титрування, 1300- добовий діурез мл, В- кількість сечі у пробі- 10мл.

Норма аміаку в сечі 0,4-1,0г/добу або 30-75 ммоль/добу.

Завдання 4. Якісна реакція на фенілпіровиноградну кислоту- проба Феліна.

Принцип методу. Фенілпіровиноградна кислота утворює з іонами Fe (III) комплексну сполуку, забарвлену в синьо-зелений колір.

Хід роботи. До 2мл свіжо відфільтрованої сечі наливають 8-10 крапель 10% розчину феруму хлориду. Через 30-60 сек. з’явиться синьо-зелене забарвлення, коли є ФПВК. Через 5-30 хв залежно від концентрації ФПВК колір вицвітає.

Клініко-діагностичне значення. Для діагностики фенілкетонурії.

Література

Основна:

1. Губський Ю.І.-Біологічна хімія- Київ-Тернопіль. Укрмедкнига.-2000-508с.

2. Хмелевський Ю.В.-Биологическая химия. Практикум- Київ: Вища школа.-1985-207с.

3. Обмін речовин та його показники. Методичні розробки практичних занять з біологічної хімії. За редакцією Ю.В.Хмелевського.-Київ: НМУ.-1992.-37с.

Тема заняття № 15. Дослідження згортальної, антизгортальної і фібринолітичної систем крові. Патології гемостазу.

Цілі заняття:

• Пояснювати сукупність механізмів збереження рідкого стану крові, функціональні та біохімічні властивості системи гемостазу.

• Трактувати біохімічні принципи функціонування згортальної, антизгортальної та фібринолітичної систем крові.

• Аналізувати основні фактори гемостазу, зовнішній і внутрішній шляхи згортання крові, антифібринолітичну систему.

• Аналізувати стан здоров’я людини на підставі біохімічних параметрів змін (відсутності) факторів згортання крові.

• Пояснювати причину порушень тромбоцитарного і коагуляційного гемостазу.

• Аналізувати основні показники гемостазу та фібринолітичної системи крові.

Теоретичні питання

1. Функціонально-біохімічна характеристика системи гемостазу:

• судинно-тромбоцитарний гемостаз;

• коагуляцій ний гемостаз.

2. Згортальна система крові:

• фактори згортання крові;

• механізм активації системи згортання крові;

• функціонування каскадної системи згортання крові в згортальній системі, її особливості;

• внутрішній шлях коагуляції;

• зовнішній шлях коагуляції;

• роль вітаміну К у реакціях каскаду коагуляції.

3. Схема взаємовідносин між внутрішнім, зовнішнім та загальним кінцевим шляхами коагуляції.

4. Порушення тромбоцитарного гемостазу: тромбоцитопенії, тромбоцитопатії.

5. Порушення коагуляційного гемостазу: гемофілії(А, В,С), дефект Хагемана, хвороба Стюарта-Прауера .

6. Набуті порушення, зумовлені антитілами і факторами згортання, дефіцитом вітамін-К залежних факторів згортання, лікарські коагулопатії; синдром десемінованого внутрішньо-судинного згортання (тромбогеморагічні синдроми), мікротромбоваскуліти.

7. Антизгортальна система крові:

• антикоагулянти: антитромбіни, ₁-інгібітор протеїназ, ₂-макроглобулін, гепарин, кумарини;

• механізм дії антикоагулянтів.

8. Фібринолітична система крові. Етапи фібринолізу:

• 1 етап – перетворення плазміногену на плазмін;

• 2 етап – розщеплення фібрину.

9. Фармакологічні препарати – компоненти фібринолітичної системи: плазмін, урокіназа, стрептокіназа, тканинний активатор плазміногену (ТАП), їх застосування в медичній практиці.

10. Нормальні показники основних фізіологічних антикоагулянтів: гепарину, антитромбіну, продуктів деградації тромбіну, ристоміцину

11. Зміна показників крові при синдромі набутого імунодефіциту- СНІДу.

12. Нормальні показники фібринолітичної системи крові.

Практичні роботи

Завдання 1. Визначення протромбінового (тромбопластичного) часу згортання крові.

Принцип методу. Згортання плазми крові при рекальцифікації проходить в три етапи: активація тромбокінази, перетворення під дією тромбокінази протромбіну в тромбін, утворення фібрину під впливом тромбіну. Введення кальцію в плазму збагачує її на тромбокіназу і скорочує час згортання крові.

Хід роботи. Внести в пробірку Відаля, встановлену на водяну баню (37*С), 0,1 мл плазми, 0,1мл тромбопластину і 0,7 мл 0,025М розчину хлориду кальцію. Одночасно з внесенням кальцію включити секундомір і виключити його при появі фібрину. Цей час і буде протромбіновим часом. При активності препарату промбопластину час становить 18с, норма без нього-45-60 сек. Зміна цього часу свідчить про порушення стану активації протромбіну.

Клініко-діагностичне значення. Подовження протромбінового часу згортання крові спостерігається при гіпофібриногенемії, надлишку антитромбінів, при накопиченні продуктів фібринолізу і деяких молекулярних аномаліях фібриногену. Повне незсідання крові при гіпергепаринемії і при гострому ДВЗ- синдрому, при дефіциті деяких факторів протромбінового комплеку.

Завдання 2. Визначення вмісту вільного гепарину в крові за методом Сірмаї.

Принцип методу. Метод базується на здатності толуїдинового синього зв’язувати вільний гепарин крові, що призводить до скорочення тромбінового часу.

Хід роботи. В пробірку Відаля №1 (контроль) , встановлену на водяну баню, відміряють0,05мл ізотонічного розчину натрію хлориду, в №2 (дослідну) 0,05мл толуїдинового синього і теж ставлять на водяну баню і в кожну додають по 0,1мл досліджуваної плазми. Через 30с додають по 0,1мл в кожну тромбіну і фіксують час згортання крові. Різниця в часі свідчить про кількість вільного гепарину. Норма 16-20с.

Клініко-діагностичне значення. Найважливіша функція гепарину -антикоагулянтна, яка залежить від антитромбіну III (АТ-III) і його доступності для дії гепарину. Нагромадження в плазмі крові білків гострої фази, імунних комплексів та інших компонентів, що мають здатність зв’язувати та інактивувати гепарин, призводить до порушення комплексування АТ-III до гепарину. Зниження АТ-III спостерігається при гестозах, хворобах печінки, при інтенсивному лікуванні гепарином, вживанні гормональних контрацептивів. Зменшення гепарину-при інфаркті міокарда, порушенні функції печінки, псоріазі.

Література

Основна:

1. Губський Ю.І.-Біологічна хімія. -Київ-Тернопіль.Укрмедкнига-2000-508с.

2. Бишевський А.Ш.,ТерсеновО.А,- Біохімія для лікаря-Київ: Український Центр духовної культури.- 2001.- 395с.

3. Лабораторные методы исследования системы гемостаза. Под редакцией Е.Д.Гольдберга.- Томск- 1980- 313с.

Додаткова:

4. Берёзов Т.Т., Коровкин Б.Ф.- Биологическая химия - Москва: Медицина. – 1998 - 704с.

5. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І .- Біохімія людини - Тернопіль.Укрмедкнига.- 2000 - 744с.

Тема заняття № 16. Дослідження біохімічних закономірностей реалізації імунних процесів. Імунодефіцитні стани.

Цілі заняття:

• Аналізувати біохімічний склад крові та пояснювати діагностичну роль білків плазми крові, імунної системи в забезпеченні опірності організму людини до інфекцій в нормі та за умов розвитку патології.

• Аналізувати стан здоров’я людини на підставі біохімічних параметрів змін проміжних та кінцевих продуктів метаболізму в крові.

• Аналізувати прояви імунологічної недостатності на підставі змін біохімічних параметрів крові.

• Пояснювати механізми розвитку патологічних станів імунодефіцитів.

Теоретичні питання:

1. Загальна характеристика імунної систем: клітинні та біо­­­хімічні компоненти.

2. Природа антигенів та шляхи їх проникнення в організм.

3. Структура різних антигенів:

3.1. Структура високомолекулярних антигенів:

• Антигенна детермінанта (епітоп) полісахаридного антигену

• Епітопи білків-антигенів

3.2. Структура низькомолекулярних антигенів

4. Організація імунної системи:

4.1. Типи лімфоїдних клітин:

• В-лімфоцити

• Т-лімфоцити

4.2. Будова лімфоїдних клітин:

• Білки-рецептори В-лімфоцитів – мембранні форми імуноглобулінів

• Білки-рецептори Т-лімфоцитів

4.3. Функції лімфоїдних клітин:

• Регуляторна функція Т-хелперів, Т-супресорів

• Цитотоксична функція Т-ефекторів – клітинний імунітет.

• Секреторна функція плазматичних клітин.

5. Імуноглобуліни (антитіла):

5.1. Структура антитіл:

• Пептидні ланцюги

• Доменна структура

• Константна ділянка

• Варіабельна ділянка

• Активний центр молекули імуноглобулінів

5.2. Біологічні функції:

• Гуморальний імунітет

5.3. Механізми регуляції синтезу імуноглобулінів.

5.4. Біохімічні характеристики ок­­­ремих класів імуноглобулінів людини

(IgG, IgA, IgM, IgD, IgE).

6. Медіатори та гормони імун­­­ної системи:

6.1. Основні класи цитокінів:

• Інтерлейкіни (IL)

• Інтерферони: молекулярні механізми противірусної дії

• Білково-пеп­­­тидні фактори регуляції росту та проліферації клітин (фактори некрозу пухлин (TNF), колонієстимулюючі фактори росту (КСФ), трансформуючі фактори росту (ТФР))

7. Біохімічні компоненти системи комплементу людини.

7.1. Шляхи активації системи комплементу:

• Класич­­­ний механізми активації;

• Альтернативний (пропердиновий) механізм активації

1. Біохімічні механізми імунодефіцитних станів:

• Первинні (спадкові)

• Вторинні імунодефіцити;

• Синдром набутого імуноде­­­фіциту людини.

Практичні роботи:

Завдання 1. Визначення наявності гістаміну у розчині за специфічною кольоровою реакцією із солями кобальту.

Принцип методу. Гістамін реагує із солями кобальту з утворенням забарвлених комплексних солей.

Хід роботи. 0,01-0,02 г гістаміну розчиняють в 1 мл води, додають 2-3 краплі розчину кобальту нітрату Co(NO₃)₂, або кобальту хлориду CoCl₂ й 1 краплю NaOH. Випадає осад червоно-фіолетового кольору.

Клініко – діагностичне значення. Гістамін є продуктом реакції декарбоксилювання L-гістидину, міститься в гранулах тканинних базофілів. Одним з фізіологічних ефектів гістаміну є участь його в імунологічних реакціях. Збільшення вмісту гістаміна в зоні запалення й ділянках взаємодії антигену з антитілом є одним з патогенетичних механізмів розвитку алергічних і анафілактичних реакцій.

Завдання 2. Визначення активності лізоциму у сироватці крові.

 Принцип метода. Показником активності лізоциму служить величина, яка дорівнює різниці між процентом світлопропускання досліджуваної суміші після 1,5-годинної інкубації та процентом світлопропускання вихідної мікробної культури.

Хід роботи. В пробірку вносять по 0,03 мл досліджуваної сироватки, по 1,47 мл мікробної культури мікрокока. Обережно струшують, а потім додають по 0,03 мл вітаміну В₆ (вітаміну С) різної концентрації і витримують в термостаті при t=39°С 1,5 години. Після інкубації вимірюють оптичну густину на фотокалориметрі.

Приклад розрахунку: оптична густина культури 20; оптична густина дослідних проб після інкубації - 28 од.;

активність лізоциму в сироватці: 28 - 20 = 8 (%)

Клініко – діагностичне значення. Лізоцим (мурамідаза) слини – фермент, вміст якого складає 0,15-0,25 г/л, тобто біля 5% всіх білків слини. Основним джерелом є секрет підщелепних залоз, в привушних залозах його вміст менший. Лізоцим має високі антибактеріальні властивості, оскільки руйнує клітинну стінку бактерій.

Клітини бактерій вкриті жорсткою пористою оболонкою пептидогліканової природи – муреїном. Муреїн побудований з довгих ланцюгів (ниток) полісахаридів, що складаються з N-ацетилглюкозаміну та N-ацетилмурамової кислоти. Полісахаридні ланцюги зшиті між собою білковими (пента- та тетра-пептидними) олігопептидами. Клітинна стінка (муреїн) - це гігантська мішковидна молекула пептидоглікану, що охоплює всю клітину. Лізоцим розщеплює глікозидні зв’язки між N-ацетилглюкозаміном та N-ацетил-мурамовою кислотою в полісахаридах, і клітина гине.

Література:

Основна:

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – 508с.

2. Обмін речовин та його показники. Методичні розробки практичних занять з біологічної хімії. За ред. Ю.В.Хмелевського. – Київ: НМУ. – 1992. – 37 с.

Додаткова:

3. Гонський Я.І. Біохімія людини.- Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – 744 с.

4. Практикум з біологічної хімії. За ред. О.Я.Склярова.- Київ: Здоров’я. –2002. –298 с.

5. Сибірна Н.О., Великий М.М. Цитологічні та фізико- хімічні методи дослідження крові. – Метод.посібіник.- Львів: Видавництво ЛДУ ім. Івана Франка, 1997.- 69 с.

Тема заняття 17. Дослідження процесів біотрансформації ксенобіотиків та ендогенних токсинів. Мікросомальне окислення, цитохром Р-450.

Цілі заняття:

• Трактувати біохімічні механізми функціонування детоксикаційної системи печінки: реакції мікросомального окислення та кон’югації в біотрансформації ксенобіотиків та ендогенних токсинів;

• Пояснювати молекулярні основи генетичного поліморфізму та індуцибельної природи цитохрому Р-450;

• Аналізувати причини розвитку толерантності до лікарських засобів при їх тривалому використанні;

• Пояснювати біохімічні основи розвитку недостатності функцій печінки за умов хімічного, біологічного та радіаційного ураження.

Теоретичні питання:

1. Детоксикаційна функція печінки: біотрансформація ксенобіотиків та ендогенних токсинів.

2. Основні стадії біотрансформації чужорідних хімічних сполук в печінці:

• перша стадія – окислювально-відновлювальні та гідролітичні реакції;

• друга стадія – реакції синтезу, або кон’югації.

3. Реакції мікросомального окислення:

• мікросомальні оксигенази (монооксигенази);

• електронотранспортні ланцюги мембран ендоплазматичного ретикулуму;

• цитохром Р-450;

• каталітичний цикл функціонування цитохрому Р-450.

4. Генетичний поліморфізм та індуцибельність біосинтезу цитохрому Р-450.

5. Виникнення та природа розвитку толерантності до лікарських засобів.

6. Реакції кон’югації в гепатоцитах:

• реакції глюкуронування за участю УДФ-глюкуронової кислоти;

• реакції сульфатування за участю 3-фосфоаденозин-5-фосфосульфату;

• реакції метилування за участю S-аденозилметіоніну;

• реакції ацетилування за участю ацетил-S-КоА;

• реакції кон’югації з гліцином.

7. Приклади реакцій детоксикації ендогенних токсинів в печінці:

• знешкодження білірубіну – продукту розпаду гему;

• знешкодження скатолу та індолу – продуктів перетворення триптофану.

Практичні роботи

Завдання 1. Виявлення індикану в сечі (проба Обермейера).

Принцип методу. Індикан (тваринний індикан) – калієва сіль індоксилсульфату. Метод ґрунтується на перетворенні індикану в індоксил в процесі кислотного гідролізу ефірного зв’язку сильною мінеральною кислотою (хлористоводнева кислота). Утворений індоксил, в присутності тимолу, окислюється хлоридом заліза до індиголігнону – сполуки рожево-фіолетового кольору.

Хід роботи. До 4 мл сечі додають 2 мл 10%-го розчину ацетату свинцю [Pb (CH₃COOH)₂] для осадження жовчних пігментів, солей та інших речовин, що заважають проведенню реакції. Утворений осад відфільтровують. До 2 мл фільтрату додають 1 мл 5%-го розчину тимолу в 96%-ому етиловому спирті та 2 мл реактиву Обермейера (0,4 г хлориду заліза - FeCl_3, розчиненого в 100 мл хлористоводневої кислоти). Через 10 хв. додають 1 мл хлороформу, обережно перемішують і спостерігають за утворенням двох шарів: верхнього – водного та нижнього – хлороформового. Нижній, хлороформовий шар забарвлюється в рожево-фіолетове забарвлення. При вираженій індиканурії інтенсивність забарвлення посилюється до червоно-фіолетового кольору. Це дає змогу робити напів-кількісну оцінку результатів.

З метою подальшого уточнення отриманого результату, нижній хлороформовий шар відбирають піпеткою, переносять в іншу пробірку і додають декілька крапель 20%-го розчину тіосульфату натрію. За відсутності індикану в сечі забарвлення зникає після додавання тіосульфату натрію. При позитивній реакції, за наявності індикану в сечі, забарвлення шару хлороформу не зникає після додавання тіосульфату натрію.

Клініко-діагностичне значення.

Індикан – калієва або натрієва сіль індоксил-сульфату міститься в нормальній сечі в слідових кількостях і не виявляється звичайними лабораторними методами. Гіперіндиканемію та появу великої кількості індикану в сечі (гіперіндиканурію) спостерігають у разі посилення процесів мікробного гниття білків в кишечнику при закрепах, завороті кишки, інших видів кишкової непрохідності або зниженні травної функції шлунково-кишкового тракту.

Посилений розпад білків в тканинах організму при злоякісних новоутвореннях, абсцесах, формуванні гнійних ексудатів, гнійних процесах у легенях, туберкульозі також супроводжується значним утворенням індикану та зростанням його вмісту в сечі.

Завдання 2. Визначення анілін-п-гідроксилазної активності мікросом печінки.

1 Етап. Виділення мікросомальної фракції печінки (демонстрація).

Принцип методу. Клітини печінки містять велику кількість спеціалізованих субклітинних органел – мембран ендоплазматичного ретикулума. Саме в мембранах ендоплазматичного ретикулума знаходяться ферменти першої стадії біотрансформації ксенобіотиків та ендогенних токсинів - монооксигенази, що здійснюють реакції окислювального гідроксилювання гідрофобних субстратів: електронтранспортні ланцюги, цитохром Р-450. В процесі руйнування клітин, подрібнені мембрани ендоплазматичного ретикулума замикаються в дрібні міхурці – везикули, які відділяють методом диференційного центрифугування як фракцію мікросом. Тому реакції першої стадії отримали назву „реакцій мікросомального окислення”, а відповідні ферменти – „ мікросомальних оксигеназ”.

Для виділення фракції мікросом тканину печінки розтирають (гомогенізують) у механічному гомогенізаторі з тефлоновим пестиком, додаючи розчин сахарози. Виділення мікросом з гомогенату здійснюють на рефрижераторній центрифузі. Гомогенат переносять в центрифужні пробірки і поміщають в ротор центрифуги. Швидкість осадження частинок під дією відцентрової сили залежить від їх маси та розміру. В залежності від швидкості обертання ротора і часу центрифугування будуть осаджуватись певні частинки.

Матеріали і реактиви: тканина печінки; розчин № 1 – середовище для виділення мікросом (0,25 М розчин сахарози і 0,01 М розчин етилендиамінотетраоцтової кислоти (ЕДТО – для зв’язування кальцію) з рН = 7,6); розчин № 2 – середовище для отримання суспензії мікросом (1,15% розчин KCl в 0,02 М розчині трис-буфера з рН = 7,5). Всі розчини охолоджують до + 2^оС.

Хід роботи. Тканину печінки подрібнюють, зважують та гомогенізують в десятикратному об’ємі охолодженого розчину № 1 протягом 10 хвилин при швидкості обертання пестика – 600 об/хв. Всі подальші процедури проводять при температурі +1-2^оС. Гомогенат звільняють від ядер та обривків клітинних мембран шляхом центрифугування протягом 6 хв. при 700g. Отриману надосадову рідину (супернатант) переносять в інші центрифужні пробірки та повторно центрифугують потягом 10 хв. при 7000g, відділяючи мітохондрії. Постмітохондріальну фракцію знову центрифугують протягом 60 хв. при 105000g і отримують осад мікросом. Отриманий осад мікросом ресуспендують в невеликому об’ємі розчину № 2, визначають вміст білка та використовують для визначення активності ферментів мікросомального окислення. (Роботу виконують лаборанти).

2 Етап. Визначення анілін-п-гідроксилазної активності мікросом печінки.

Принцип методу. Швидкість реакцій гідроксилювання в мембранах ендоплазматичного ретикулума печінки значно посилюється при інтоксикації ксенобіотиками, ендогенними токсинами, при вживанні лікарських засобів, під впливом фізіологічно активних сполук (гормонів, вітамінів, тощо).

Метод визначення активності ґрунтується на визначенні вмісту 4-амінофенолу, який утворюється при гідроксилюванні аніліну в монооксигеназному ланцюгу мікросом при участі цитохрому Р-450. При взаємодії 4-амінофенолу з фенолом в присутності карбонату натрію утворюється індо фенольний комплекс синього кольору.

Хід роботи. У три пробірки (контрольну, дослідну №1 та дослідну №2) вносять по 0,4 мл трис-HCl буферу (рН = 7,4), 0,4 мл 0,16 М розчину хлориду магнію, 0,1 мл суспензії мікросом (в контрольну та дослідну №1 вносять мікросоми нормального щура, в дослідну №2 – мікросоми щура, якому попередньо було введено індуктор мікросомального окислення – фенобарбітал), 0,2 мл 0,03 М розчину НАДФН і 0,11 мл свіжоперегнаного 0,03 М розчину аніліну. В контрольну пробу додають 0,5 мл 15% розчину три хлороцтової кислоти (ТХО). Пробірки поміщають на 20 хв. в термостат при 37^оС.

По закінченні інкубації до дослідної проби додають 0,5 мл 15% розчину ТХО для зупинки реакції. Пробірки центрифугують протягом 10 хв. при 700g.

Відбирають з кожної пробірки по 1,0 мл над осадової, додають по 0,5 мл 10% розчину карбонату натрію і по 1,5 мл 2% розчину фенолу, розчиненого в 0,2 М розчині гідроксиду натрію. Вміст пробірок перемішують. Для розвитку забарвлення пробірки поміщають на 30 хв. в термостат при 37^оС. Екстинкцію дослідних проб вимірюють проти контрольної на фотоелектроколориметрі при 630 нм (червоний світлофільтр) в кюветі з товщиною шару – 10 мм.

Розрахунок анілін-п-гідроксилазної активності. Для розрахунку активності будують калібрувальний графік. Для цього беруть декілька пробірок з різними стандартними розчинами 4-амінофенолу. У всі пробірки додають по 0,5 мл 10% розчину карбонату натрію та по 1,5 мл 2% розчину фенолу в 0,2 М розчині гідроксиду натрію. Вимірюють екстинкцію проб проти контролю і будують калібрувальний графік.

Розрахунок проводять за формулою:

Х = А  V / 20  m

Де Х – гідроксилазна активність в нмоль на 1 мг білка за хвилину;

А – вміст 4-амінофенолу в пробі, знайдений по калібрувальному графіку в нмоль;

V – об’єм проби, рівний 1,71 мл;

M – вміст білка в пробі, в мг.

За результатами проведеного експерименту зробити висновок щодо впливу фенобарбіталу на гідроксилазну активність мікросомальної фракції печінки.

Клініко-діагностичне значення. Порушення детоксикаційної функції печінки проявляється зниженням перетворення (гідроксилювання) та кон’югації ендогенних (білірубін, індол, скатол) та екзогенних (бензойна кислота, спирти, фармакологічні препарати) сполук.

Порушення метаболічних процесів достовірно відображають функціональні тести:

• за змінами активності ферменту – анілін-п-гідроксилази та за антипіриновим тестом оцінюють потужність монооксигеназних реакцій мікросомального окислення (перша стадія детоксикації);

• за тестом з бензойною кислотою оцінюють активність процесів кон’югації (друга стадія детоксикації).

Клінічно важливим прикладом оцінки інтенсивності реакції кон’югації з гліцином є утворення гіпурової кислоти при взаємодії ендогенного гліцину з введеною в організм бензойною кислотою. Визначення кількості екскретованої з сечею гіпурової кислоти після введення per os стандартної дози бензоату натрію, лежить в основі дослідження антитоксичної функції печінки. Цей тест носить назву – проба Квіка.

Література:

Основна:

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – 508с.

2. Будова та властивості білків, ферментів, вітамінів і гормонів. Методичні розробки практичних занять з біологічної хімії. За ред. Ю.В.Хмелевського. – Київ: НМУ. – 1992. – 31 с.

3. Обмін речовин та його показники. Методичні розробки практичних занять з біологічної хімії. За ред. Ю.В.Хмелевського. – Київ: НМУ. – 1992. – 37 с.

Додаткова:

4. Вороніна Л.М. Біологічна хімія. – Харків: Вид-во НФАУ, 2000. – 600 с.

5. Практикум з біологічної хімії. Під ред. О.Я.Склярова.- Київ: Здоров’я. –2002. –298 с.

Тема заняття № 18. Дослідження нормальних та патологічних компонентів сечі.

Цілі заняття:

• Трактувати біохімічні механізми сечоутворювальної функції нирок, роль нирок в регуляції електролітного складу сечі та рН рідин організму. Регуляція водно-сольового обміну та функцій нирок в організмі людини.

• Аналізувати біохімічний склад сечі в нормі та за умов розвитку патологічних процесів, оцінювати функціональне значення кінцевих продуктів азотистого обміну.

• Трактувати біохімічні механізми регуляції водно-сольового обміну та роль нирок в утворенні сечі.

• Аналізувати стан здоров’я людини на підставі біохімічних параметрів змін проміжних та кінцевих продуктів метаболізму в крові та сечі.

• Використовувати результати біохімічного аналізу для оцінки стану здоров’я людини.

Теоретичні питання

1. Внутрішньоклітинна та позаклітинна рідини організму людини.

2. Особливості будови нирок та механізм утворення сечі;

• клубочкова фільтрація;

• реабсорбція та секреція.

• роль активного і пасивного транспорту в реабсорбції речовин у канальцях нирок.

3. Роль норок та легень у підтриманні кислотно-основного балансу організму людини.

4. Роль нирок у регуляції параметрів позаклітинної рідини.

5. Складові компоненти нормальної сечі:

• небілкові азотовмісні компоненти сечі: сечовина, сечова кислота, креатинін, креатин, гіпуронова кислота, індикан, пігменти;

• безазотисті компоненти сечі: глюкоза, кетонові тіла, піруват, мінеральні солі.

6. Об’єм сечі, колір, рН, кількість сечі. Діурез, поліурія, олігоурія, анурія.

7. Роль паратгормону, кальцитоніну, вітамінів в процесі сечоутворення.

8. Патологічні компоненти сечі:

• протеїнурія;

• глюкозурія;

• кетонурія;

• білірубінурія.

9. Характеристика умов утворення каменів в нирках, їх хімічний склад та заходи профілактики.

10. Ренін-ангіотензинова система в регуляції артеріального тиску та водно-сольового обміну в організмі людини.

Практичні роботи

Завдання 1. Визначення білка в сечі.

Принцип методу. Для виявлення білку в сечі найчастіше застосовують реакцію осадження за допомогою сульфосаліцилової кислоти.

Хід роботи. У пробірку №1 і №2 наливають відповідно по 2мл сечі нормальної і патологічної. В обидві додають по 5 крапель 20% розчину сульфосаліцилової кислоти . За наявності білка в сечі утвориться білий осад або муть.

Клініко-діагностичне значення. Сеча здорової людини не містиь практично білка. Білок з’являється в сечі (альбумінурія)при порушенні фільтраційної мембрани, при серцевій декомпенсації, інколи під час вагітності, при гіпертонії та інфекційних захворюваннях нирок.

Завдання 2. Визначення глюкози в сечі.

Принцип методу. Метод базується на властивості глюкози при нагріванні окислюватись з утворенням оксиду міді 1червоного кольору.

Хід роботи. До сечі додають 10 крапель реактиву Фелінга. Перемішують. Нагрівають до кипіння. При наявності глюкози утворюється жовтий або червоний осад. Колір осаду залежить від вмісту глюкози в сечі.

Клініко-діагностичне значення. У нормі концентрація глюкози в крові становить 2,77 - 5,55ммоль/л. Якісне та кількісне визначення цукру в крові та сечі має важливе клініко-діагностичне значення.В сечі вміст глюкози менше 2,77ммоль/л. Підвищення глюкози в сечі спостерігається при всіх випадках гіперглікемії - це глюкозурія. Вона буває при цукровому діабеті, аліментарній гіперглікемії, акромегалії, синдромі Іценка-Кушінга, тощо.

Завдання 3. Визначення кетонових тіл в сечі - проба Легаля.

Принцип методу. Ацетон і ацетооцтова кислота з нітропрусидом натрію в лужному середовищі утворюють продукти реакції, зафарбовані в червоний колір.

Хід роботи. В дві пробірки наливають по 0,5 мл сечі (норма і патологія), додають по 0.5 мл розчину гідроксиду натрію і по 5-7 крапель нітропрусиду натрію. Поява вишневого кольору свідчить про вміст кетонів у сечі.

Клініко-діагностичне значення. У нормі за добу виділяється 20-40мг кетонових тіл. Збільшення кількості кетонових тіл у крові (кетонемія) і сечі (кетонурія) спостерігаються при цукровому діабеті, дефіцитівуглеводів у харчуванні, тиреотоксикозі, ураженні печінки, важких інтоксикаціях.

Завдання 4. Визначення жовчних пігментів у сечі реакцією Гмеліна.

Принцип методу заснований на окисленні жовчних пігментів концентрованою азотною кислотою і появі різно забарвлених продуктів окислення. Цей метод дає можливість визначити білірубін в розведеному розчині 1:80000.

Хід роботи. В пробірку наливають 1-2 мл концентрованої азотної кислоти і обережно по стінці добавляють 1-2 мл досліджуваної сечі. При наявності в сечі жовчних пігментів внизу пробірки появляться кольорові кільця, характерні для окислених жовчних пігментів.

Клініко-діагностичне значення. Жовчні пігменти – білірубін, білівердин і уробілін З’являються в сечі лише при патології: ураження печінки, жовчовивідних шляхів. Норма білірубіну в крові здорових людей від 8,5 – 20.5мкмоль/л.

Завдання 5. Визначення уробіліну в сечі за реакцією Богомолова.

Принцип методу. Уробілін утворює із сульфатом міді забарвлену сполуку, яка добре екстрагується хлороформом.

Хід роботи. В дві пробірки наливають по 2-3мл нормальної і досліджуваної сечі, додають по 2-3 краплі розчину сульфату міді і по 0,5 мл хлороформу. Кілька разів енергійно струшують. У присутності уробіліну хлороформ забарвлюється у рожевий колір у нижній частині пробірки.

Клініко-діагностичне значення. Уробілінурію спостерігають при паренхіматозних захворюваннях печінки (гепатит, цироз, отруєння), гемолітичних станах (гемолітична жовтяниця, гемоглобінурія, розсмоктування великих крововиливів, обширні інфаркти міокарда.

Література

Основна:

1. ГубськийЮ.І.- Біологічна хімія - Київ-Тернопіль: Укрмедкнига - 2000-508с.

2. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М. І. - Біохімія людини –Тернопіль: Укрмедкнига -2002-744с.

3. Обмін речовин та його показники. Методичні розробки практичних занять з біологічної хімії – Київ: КМУ- 1992- 37с.

Додаткова:

4. Хмелевский Ю.В.- Биологическая химия. Практикум – Київ: Вища школа- 1985- 207с.

5. Бишевський А.Ш., Терсенов О.А. – Біохімія для лікаря - Київ: Український Центр духовної культури- 2001-395с.

Перелік питань для підготовки студентів до підсумкового модульного контролю №3

Основи молекулярної біології.

1. Азотисті основи, нуклеозиди та нуклеотиди – складові компоненти молекул нуклеїнових кислот. Мінорні азотисті основи та нуклеотиди.

2. Вільні нуклеотиди (АТФ, НАД, НАДФ, ФАД, ФМН, ЦТФ, УТФ; 3',5'-АМФ, 3',5'-ГМФ) та їх біохімічні функції.

3. Нуклеїнові кислоти. Загальна характеристика ДНК та РНК, їх біологічне значення в збереженні та передачі генетичної інформації.

4. Особливості первинної структури ДНК та РНК. Зв’язки, що утворюють первинну структуру нуклеїнових кислот.

5. Вторинна структура ДНК, роль водневих зв'язків в її утворенні (правила Чаргафа, модель Уотсона-Кріка), антипаралельність ланцюгів.

6. Третинна структура ДНК. Фізико-хімічні властивості ДНК: взаємодія ДНК з катіонними лігандами, утворення нуклеосом.

7. Молекулярна організація ядерного хроматину еукаріотів: нуклеосомна організація; гістони та негістонові білки.

8. Будова, властивості й біологічні функції РНК. Типи РНК: мРНК, тРНК, рРНК. Особливості структурної організацїї різних типів РНК.

9. Нуклеопротеїни: будова, біологічні функції.

10. Біохімічний склад, будова та функції біологічних мембран.

11. Компартменталізація біохімічних процесів в клітинах.

12. Роль ліпідів у побудові біологічних мембран. Рідинно-мозаїчна модель біо-мембран.

13. Біосинтез пуринових нуклеотидів: cхема реакцій синтезу ІМФ; утворення АМФ та ГМФ; механізми регуляції.

14. Біосинтез піримідинових нуклеотидів: схема реакцій; регу­­­ляція синтезу.

15. Біосинтез дезоксирибонуклеотидів. Утворення тимідилових нук­­­леотидів; інгібітори біосинтезу дТМФ як протипухлинні засо­­­би.

16. Катаболізм пуринових нуклеотидів; спадкові порушення обміну сечової кислоти.

17. Схема катаболізму піримідинових нуклеоти­­­дів.

18. Реплікація ДНК: біологічне значення; напівконсервативний ме­­­ханізм реплікації.

19. Послідовність етапів та ферменти реплікації ДНК у прокаріотів та еукаріотів.

20. Транскрипція РНК: РНК-полімерази прокаріотів та еукаріотів, сигнали транскрипції (промо­­­торні, ініціаторні та термінаторні ділянки генома).

21. Процесинг - посттранскрипційна модифікація новосинтезованих мРНК.

22. Генетичний (біологічний) код; триплетна структура коду, його властивості.

23. Транспортні – тРНК та активація амінокислот. Аміноацил-тРНК-син­­­тетази.

24. Етапи та механізми трансляції (біосинтезу білка) в рибосомах: ініціація, елонгація та термінація.

Основи молекулярної генетики.

1. Посттрансляційна модифікація пептидних ланцюгів. Регуляція трансляції.

2. Інгібітори транскрипції та трансляції у прокаріотів та еукаріотів: антибіотики та інтерферони – їх застосування в медицині; дифтерійний токсин.

3. Регуляція експресії генів прокаріотів: регуляторні та структурні ділянки лактозного (Lac-) оперону (регуляторний ген, промотор, оператор).

4. Мутації: геномні, хромосомні, генні; механізми дії мутагенів; роль інду-кованих мутацій у виникненні ензимопатій та спадкових хвороб людини.

5. Біологічне значення та механізми репарації ДНК. Репарація УФ-індукованих генних мутацій: пігментна ксеродерма.

6. Генна інженерія: конструювання рекомбінантних ДНК; клонування генів; генно-інженерний синтез ферментів, гормонів, ін­­­терферонів та ін.

Молекулярні механізми дії гормонів на клітини-мішені.

1. Гормони: загальна характеристика; роль гормонів та інших біо­­­регуляторів у системі міжклітинної інтеграції функцій орга­­­нізму людини.

2. Класифікація гормонів та біорегуляторів: відповідність структури та механізмів дії гормонів.

3. Реакція клітин-мішеней на дію гормонів. Мембранні (іонотропні, метаботропні) та цитозольні рецептори.

4. Біохімічні системи внутрішньоклітинної передачі гормональ­­­них сигналів: G-білки, вторинні посередники (цАМФ, Са²⁺/кальмодулін, ІФ₃, ДАГ).

5. Молекулярно-клітинні механізми дії стероїдних та тиреоїдних гормонів.

Біохімія гормональної регуляції метаболізму.

1. Гормони гіпоталамуса – ліберини та статини.

2. Гормони передньої частки гіпофіза: соматотропін (СТГ), про­­­лактин. патологічні процеси, пов'язані з порушенням функції цих гормонів.

3. Гормони задньої частки гіпофіза. Вазопресин та окситоцин: будова, біологічні функції.

4. Інсулін: будова, біосинтез та секреція; вплив на обмін вуглеводів, ліпідів, амінокислот та білків. Рістстимулюючі ефекти інсуліну.

5. Глюкагон: регуляція обміну вугле­­водів та ліпідів.

6. Тиреоїдні гормони: структура, біологічні ефекти Т₄ та Т₃. Порушення метаболічних процесів при гіпо- та гіпертиреозі.

7. Катехоламіни (адреналін, норадреналін, дофамін): будова, біосинтез, фізіологічні ефекти, біохімічні механізми дії.

8. Стероїдні гормони кори наднирників (С₂₁-стероїди) – глюкокортикоїди та мінералокортикоїди; будова, властивості.

9. Жіночі статеві гормони: естрогени, прогесте­­рон. Фізіологічні та біохімічні ефекти; зв'­­­ язок з фазами овуляційного циклу.

10. Чоловічі статеві гормони (С₁₉-стероїди). Фізіологічні та біохімічні ефекти андрогенів; регуляція синтезу та секреції.

11. Гормональна регуляція гомеостазу кальцію в організмі. Паратгормон, кальцитонін, кальцитріол.

12. Ейкозаноїди: будова, біологічні та фармакологічні властивості. Аспірин та інші нестероїдні протиза­­пальні засоби як інгібітори синтезу простагландинів.

Перелік практичних робіт та завдань для підсумкового модульного контролю.

1. Пояснити механізм утворення подвійної спіралі ДНК.

2. Пояснити механізм утворення шпильок в молекулі тРНК.

3. Які надмолекулярні комплекси утворюють нуклеїнові кислоти? Визначити основні компоненти нуклеопротеїну (білка, азотистої основи, пентози, фосфорної кислоти) в його гідролізаті. Поясніть принципи методів.

4. Визначити вміст сечової кислоти в біологічній рідині з реактивом Фоліна. Поясніть принцип методу.

5. Пояснити протипухлинну дію антибіотиків. Чи всі антибіотики можуть бути використаними як протипухлинні? Поясніть механізм дій афідиколіну, актиноміцину D.

6. Обґрунтуйте механізм дії антибіотиків – інгібіторів ініціації: стрептоміцину, ауринтрикарбоксилової кислоти, рифаміцину, рифампіцину.

7. Обґрунтуйте механізм дії антибіотиків – інгібіторів елонгації: аміцетину, хлорамфеніколу, еритроміцину, циклогексиміду, пуроміцину, тетрациклінів.

8. Обґрунтуйте механізм дії антибіотиків – інгібіторів термінації: анізоміцину, хлорамфеніколу, еритроміцину, лінкоцину, стрептоміцину.

9. Поясніть механізм дії інтерферонів.

10. Поясніть механізм дії дифтерійного токсину.

11. Поясніть молекулярні механізми мутацій. Які найбільш поширені мутагени Ви знаєте?

12. Поясніть, як методи генної інженерії можуть бути використані в біології та медицині.

13. Осадження інсуліну сульфосаліциловою кислотою. Яка хімічна природа інсуліну? Чи є реакція специфічною?

14. Біуретова реакція з гормонами білкової та пептичної природи. Які гормони білкової та пептичної природи Ви знаєте?

15. Яким методом можна виявити метаболіти гормонів стероїдної природи? Які гормони відносяться до цієї групи? Поясніть принцип методу.

16. Виявлення адреналіну хлоридом заліза (III). Поясніть принцип методу. Яка хімічна природа адреналіну? Напишіть його формулу.

17. Виявлення йодовмісних гормонів. Поясніть принцип методу. Які гормони відносяться до цієї групи?

Література Основна:

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. - Київ-Тернопіль: Укрмед- книга, 2000. - 508 с.

2. Хмелевский Ю.В, Губский Ю.И., Зайцева С.Д. и др. Биологическая химия: Практикум. - К.: Вища шк., 1985. - 212 с.

Додаткова:

1. Губський Ю.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. Підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – 744 с.

2. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. Підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – 744 с.

3. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.:Медицина, 1998. – 704 с.

4. Будова та властивості білків, ферментів, вітамінів і гормонів. Методичні розробки практичних занять з біологічної хімії. За ред. Ю.В. Хмелевського. – Київ: НМУ. – 1992. – 31 с.

5. Ленинджер А. Основы биохимии: В 3 т. - М.: Мир, 1985. - 1056 с.

6. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека: В 2 т. - М.: Мир, 1993. - т.1 - 381 с.; т.2 - 414 с.

7. Беникова Е.А, Бужиевская Т.И., Сильванская Е.М. Генетика эндокринных заболеваний. К.: Наукова думка, 1993. – 400 с.

8. Теппермен Дж., Теппермен Х. Физиология обмена веществ и эндокринной системы. М.: Мир, 1989. – 653 с.