5. Виділення,очищення та дослідження мембранних білків.

Для визначення методів дослідження білків мембран необхідно враховувати: способи їх прикріплення до мембрани; функціональну класифікацію мембранних білків; а також їх класифікацію за локалізацією по відношенню до ліпідів

На відміну від ліпідів, які легко виділити з мембран і дослідити, мембранні білки виділяються складніше, що суттєво ускладнює дослідження їх структури та функцій. Практично всі методи виділення мембранних білків базуються на розщепленні слабких зв’язків між білками і ліпідами.

Методи солюбілізації (розбирання нативної мембрани на складові елементи)мембранних білків можна розділити на такі:

1) білки, адсорбовані на поверхні мембран, легко виділити розчинами з низькою іонною силою;

2) якщо білки приєднані до мембрани іонними зв’язками або якщо необхідною умовою зберігання їхньої структурної цілісності є наявність у середовищі достатньої кількості іонів, білки можна виділити, якщо видалити із середовища катіони (наприклад, за допомогою ЕДТА);

3) білки, які зв’язані електростатично, можна виділити за допомогою розчинів з високою іонною силою (0,5-1,2 М);

4) іноді можна використовувати різні денатуруючі агенти за високої концентрації (гуанідин, сечовина та ін.). Ці сполуки руйнують іонне оточення білків у мембранах, розщеплюють слабкі зв’язки. Недолік їх використання полягає у тому, що білки при солюбілізації інактивуються;

5) як попередню стадію розщеплення мембран, використовують обробку гідролітичними ферментами (наприклад, папаїн, трипсин, фосфоліпази);

6) для фрагментації мембран можна використовувати ультразвук;

7) детергенти, які є амфіфільними сполуками, зв’язуються гідрофобно з мембранними білками, полярні групи яких взаємодіють з водою.

Для фракціонування препаратів мембран використовують диференційне центрифугування.

Очищення мембранних білків. Для очищення інтегральних мембранних білків та одержання їх у біохімічно активній формі необхідні детергенти, які дозволяють солюбілізувати білки та зберігати їх у розчині. Для виділення інтегральних мембранних білків розроблено багато спеціальних методик, однак більшість схем очищення ґрунтується на хроматографічних і гідродинамічних методах, які використовують для розчинних білків. Це хроматографія (Які є наявні різновиди хроматографій?)на ДЕАЕ- целюлозі, сефарозі або гідроксилапатиті, гель-фільтрація, центрифугування за градієнтом густини сахарози та ін. Дуже важливо зробити правильний вибір детергенту, оскільки саме детергент руйнує мембрану, займаючи місце ліпідів, які оточують той чи інший білок, та визначає стабільність білка в розчині.

Детергенти. Упродовж останніх десятиліть з’явилось багато різних детергентів. Класифікація: 1) іонні: а) катіонні (мають додатній заряд), б) аніонні (мають від’ємний заряд), в) цвіттер-іонні; 2) неіонні.

Неіонні детергенти – тритон, твіни. Аніонні детергенти представлені холатом і дезоксихолатом натрію, а також найбільш широко використовуваним додецилсульфатом натрію. Він викликає дисоціацію білків на мономери, утворюючи з ними впорядковані комплекси. Ці комплекси легко розділяють за допомогою гель-електрофорезу.

Оптимально знайти такий детергент, який би не порушував вторинної і третинної структури мембранних білків, а лише б заміщував більшість або усі мембранні ліпіди, які контактують з гідрофобними ділянками білкової молекули. Кінцевою метою солюбілізації є вбудовування білка в детергентну міцелу. Далі очищення полягає у розділенні цих білково-детергентних комплексів. Одна з проблем – підбір оптимальних умов солюбілізації досліджуваного білка. Були спроби вибору необхідного детергенту за допомогою одного параметра, який називається гідрофільно-ліпофільний баланс (ГЛБ). Цей параметр змінюється від 1 до 20. Значення ГЛБ детергенту можна використовувати для передбачення його поведінки у біологічних системах: у діапазоні 12,5-14,5 – найбільш ефективні розчинники інтегральних мембранних білків. Однак з’ясувалось, що пошук оптимальних детергентів для певного мембранного білка потребує врахування багатьох факторів, внаслідок чого він повинен супроводжуватися емпіричною перевіркою.

Параметри, які характеризують здатність детергентів до міцелоутворення:

1 – критична концентрація міцелоутворення (ККМ);

2 – число агрегації.

ККМ – це та концентрація, за якої детергент починає утворювати міцели.

Число агрегації показує, скільки молекул детергенту припадає на одну міцелу.

Видалення детергенту: діаліз, гель-фільтрація, сильне розведення солюбілізату, адсорбція детергенту на гідрофобних полімерах.

Необхідно враховувати:

1. максимальну солюбілізацію досліджуваного білка.

Критерієм є перехід білка в супернатант після центрифугування, при якому відбувається осадження мембрани (наприклад, після центрифугування при 100 000g 1 годину);

2) солюбілізацію білка у потрібній формі.

Як правило, це стосується збереження його ферментативної активності. Іноді використовують спектральні характеристики або наявність білкових асоціатів. Крім того, необхідною умовою є стабільність білка після солюбілізації. У деяких випадках для підтримання біохімічної активності разом з детергентом додають екзогенні фосфоліпіди. Для стабілізації білка після солюбілізації також додають гліцерол (цей підхід використовують у випадку розчинних білків). Іноді використовують інгібітори протеаз і проводять солюбілізацію за умов, які зводять до мінімуму ймовірність протеолітичного розщеплення білків;

3) ймовірність використання детергента за цієї методики.

У першу чергу необхідно враховувати заряд детергенту (іонообмінна хроматографія), властивості конкретного значення рН (наприклад, солі жовчних кислот часто випадають в осад при рН<8), розмір міцел детергенту, ККМ. Ці останні параметри особливо важливі: детергенти з низькою ККМ утворюють великі міцели. Вони не видаляються при діалізі або ультрафільтрації через низьку концентрацію мономерів детергенту. З практичної точки зору це означає, що якщо концентрувати білок за допомогою ультрафільтрації, тоді буде зростати і концентрація детергенту з низькою ККМ, що може призвести до денатурації білка. Тому переважно використовують детергенти з високими ККМ (наприклад, октилглюкозид, солі жовчних кислот, цвіттеріонні детергенти). Цінними є полістиренові смоли, наприклад, біобідз SM-2. Вони вибірково зв’язуються з детергентами типу тритон Х-100, видаляють їх з розчину (отже, можна обійтися без діалізу). Необхідно врахувати ще один фактор – поглинання світла детергентом: деякі детергенти поглинають у ближній УФ-ділянці, що унеможливлює визначення концентрації білка за вимірюванням оптичної густини при довжині хвилі 280 нм.

Білки. Периферичні білки вивільняються під час промивання мембрани буферними розчинами з низькою іонною силою та буферними розчинами з високим або низьким значенням рН за присутності хелатуючих агентів (ЕДТА), які зв’язують двовалентні катіони. Можна проводити розділення за допомогою пертурбуючих білків, так званих хаотропних агентів, які виявляють достатньо сильну дію, щоб зруйнувати білок-білкові взаємодії, хоча денатурації білків у цьому випадку не відбувається. Дія хаотропних агентів обумовлена, головним чином, послабленням гідрофобних взаємодій між компонентами мембрани.

Для вивільнення інтегральних мембранних білків необхідно використовувати детергенти або органічні розчинники. Детергенти руйнують ліпідний бішар і, як вважають, зв’язуються з гідрофобними ділянками мембранних білків, які контактують з гідрофобною частиною бішару.

Методи хроматографічного аналізу при розділенні білків мембран.

(Пригадаємо із загального курсу біофізики, за якими параметрами можна розділити білки?)

Периферичні білки, виділені з мембран, подібні за властивостями до звичайних водорозчинних білків. Їх можна фракціонувати за допомогою стандартних прийомів, які базуються на відмінності білків за розміром, зарядом, специфічності взаємодії з лігандами. Складніше вивчати мембранні білки.

Розділення за розміром. Якщо білок, який вивчається, стабільний, тоді фракціонування можна почати з гель-фільтрації у водному буфері, який містить детергент за концентрації, що дорівнює, або перевищує ККМ. Інтегральні білки, оточені мономолекулярною «шубою» детергенту, можуть мати масу, яка перевищує ту, що відповідає амінокислотній послідовності. Для колонкової хроматографії прийнято використовувати крупнопористі носії – сефароза, агароза, поліакриламід. Недоліки: можуть виникнути складності у зв’язку з агрегацією білків або їх незворотною адсорбцією на хроматографічних носіях.

Ефективність початкових етапів фракціонування залежить, перш за все, від правильного вибору детергента. Якщо є ймовірність незворотної адсорбції білка, тоді можна спробувати замінити носій. Носії на основі поліакриламіду, як правило, більш інертні. Їх можна використовувати як з м’якими, так і з жорсткими (денатуруючими) детергентами.

Якщо процес очищення лімітується кількістю білка і часом його фракціонування, найбільш оптимальним є застосування хроматографічних систем, які базуються на принципах швидкісної рідинної хроматографії білків (ШРХ) та високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ). Великий вибір носіїв, головним чином, на основі силікагелю та синтетичних полімерних матеріалів, дозволяє розділяти білки з молекулярною масою від 500 до 2•10⁷. При розділенні необхідно враховувати значення рН (особливо, рН>8 і pH<6).

Розділення за зарядом. Іонообмінна хроматографія. Для виділення мембранних білків можна використовувати класичні іонообмінні системи. Найбільш популярні слабкозаряджені ДЕАЕ- та КМ-іоніти (на основі целюлози і декстрану). Якщо їх використовувати за присутності детергента, тоді потрібно впевнитись, що він не перешкоджає взаємодії білка з адсорбентом.

Ефективність очищення залежить від властивостей білка: якщо білок гідрофільний, можна підібрати умови, за яких він буде міцно зв’язуватись з іонітом. Білки, які занурені у бішар, після солюбілізації щільно оточені детергентною оболонкою, тому менш ймовірна взаємодія із зарядженим адсорбентом. З урахуванням цього ДЕАЕ-колонки, як правило, зрівноважують буфером низької іонної сили (наприклад, 0,1 М трис-НСl або фосфатним буфером), що містить детергент (0,1%) при рН 6,5–8,0. Елюювання проводять сольовими розчинами зростаючих концентрацій (0-1 М NaCl або КCl), які також містять детергент. КМ-сорбенти, як правило, зрівноважують при слабкокислих рН (5,5–7,0), а для елюювання найчастіше використовують розчини з градієнтом рН, а не солі.

Для ВЕРХ отримані іонообмінні силікагелі та синтетичні смоли з різними розмірами пор. Вони ефективніші, ніж носії для гель-фільтрації. Ще одним носієм, використання якого виявилось успішним для дослідження мембранних систем, є гідроксилапатит.

Ізоелектричне фокусування. Для мембранних білків також характерна відмінність за ізоелектричними точками. Цю властивість можна використовувати для ефективної очистки білків методом ізоелектричного фокусування. Білки мігрують під дією електричного поля за градієнтом рН і коли певний білок досягає ділянки, що відповідає його ізоелектричній точці, його подальша міграція припиняється. Цим методом вдається досягти ефективного розділення компонентів.

Хроматофокусування. Цей перспективний метод очищення інтегральних білків подібний до ізоелектричного фокусування, але відрізняється тим, що градієнт рН формують не в буфері, а на нерухомому наповнювачі колонки. Наповнювачі стійкі в діапазоні значень рН від 3 до 12. Найчастіше використовують інтервал рН 5-9.

Гідрофобна хроматографія. В її основі лежить зв’язування білків з гідрофобними групами, ковалентно пришитими до носія. Адсорбція білків на носії, наприклад, фенілсефарозі, відбувається за рахунок гідрофобних взаємодій і посилюється за високих концентрацій солей, низьких рН. Потім проводять елюювання білка сольовими розчинами. Вихід препарату покращується при підвищенні рН. У деяких випадках цей метод може бути ефективним для розділення інтегральних білків від периферичних. Ефективність модифікованого носія може знижуватися за присутності детергенту.

ІІІ Заключна частина.

Отже, ми сьогодні охарактеризували інтегральні та периферичні мембранні білкі, ферменти, відповідальні за відщеплення пептидного якоря (секретази), розглянули приклади бітопічних та політопічних білків мембран, а також білки, ковалентно зв’язані з ліпідами. Ознайомилися з поняттям «детергенти» та параметрами, які характеризують здатність детергентів до міцелоутворення. Були зазначені основні проблеми виділення та очищення білків, а саме вибір правильного детергенту, визначення методів дослідження білків мембран, де необхідно враховувати: способи прикріплення до мембрани; функціональну класифікацію мембранних білків; а також їх класифікацію за локалізацією по відношенню до ліпідів.

Нагадую про питання на самостійне опрацювання!

21