Методи діагностики вірусних хвороб
Діагностика вірусних хвороб рослин полягає у встановленні вірусу, який викликає дане захворювання. До основних методів діагностики фітопатогенних вірусів належать наступні:
візуальний;
встановлення інфекційності захворювання;
серологічний;
метод рослин-індикаторів;
електронно-мікроскопічний;
внутрішньоклітинних включень;
анатомо-цитологічний;
люмінесцентного аналізу;
хімічний.
Найкраще, коли для діагностики використовують комплекс кількох методів.
Візуальний метод
Діагностика вірусних хвороб за зовнішніми симптомами – найшвидший метод. Однак його можна вважати лише попереднім у зв’язку з тим, що симптоми вірусних хвороб можуть змінюватися в залежності від ряду факторів (штаму вірусу, сорту рослини-господаря, зовнішніх умов), а при поєднанні певних умов вони можуть зникати (маскуватися).
Численні випадки співпадання зовнішніх проявів вірусних хвороб із симптомами, викликаними неінфекційними причинами, утруднюють, а іноді роблять неможливою їхню візуальну діагностику.
При діагностиці захворювання можна обмежитися зовнішніми ознаками лише в тих випадках, коли симптоми дуже чіткі і характерні лише для цього захворювання.
Встановлення інфекційності
Встановлення інфекційності рослини у багатьох випадках передує іншим методам вивчення хвороби. Підтвердженням інфекційності слугує отримання симптомів захворювання при використанні прийомів. що забезпечують передачу вірусу від досліджуваної рослини до контрольної. Для цього використовують способи інокуляції рослин: соком, за допомогою комах-переносників, щепленням, за допомогою повитиці тощо. Спосіб інокуляції визначається особливостями вірусу, його стійкістю, способом поширення в природних умовах і т.д.
Час від інокуляції до появи перших ознак зараження може становити від 3 до 30 днів у залежності від виду вірусу та рослини, яку заражають.
Підтвердженням інфекційності слугує розвиток симптомів на заражених листках (місцеві некрози, хлоротичні плями та ін.) або на відростаючих частинах рослини (посвітління жилок листків, деформація, системний некроз, мозаїка, хлороз тощо).
Однак якщо, наприклад, при інокуляції соком симптоми захворювання не проявилися, це ще не свідчить про відсутність інфекційності, оскільки ряд вірусів не передається контактно-механічним шляхом. У цьому випадку необхідно продовжити дослідження способом щеплення.
Щепленням передаються усі віруси. Для встановлення інфекційності досліджувану рослину використовують як в якості прищепи, так і підщепи. Для передачі вірусної інфекції не потрібно, щоб компоненти щеплення зрослися – достатньо їхнього контакту протягом 3-5 діб. Ознаки зараження зазвичай проявляються на молодих листках. Відсутність симптомів хвороби свідчить, що захворювання неінфекційне.
Після того, як встановлена інфекційність, тобто вірусна природа хвороби, необхідно ідентифікувати вірус.
Серологічний метод
При діагностиці рослинних вірусів цей метод найпоширеніший. Його суть полягає у тому, що при введенні тварині чужорідного білка в її організмі утворюються антитіла, здатні зв’язувати чужий білок і переводити його в нешкідливий для організму стан. Речовини, які при введенні тваринам викликають у них утворення антитіл, називаються антигенами, а реакція між антигеном і антитілом – серологічною реакцією.
Віруси (як і бактерії, гриби, білки тварин і рослин) при введенні в кров тварини (кроля, коня тощо) здатні спричиняти накопичення в плазмі крові антитіл. Тому, щоб перевірити, чи міститься в рослині певний вірус, її сік змішують із сироваткою крові обробленої тварини. Якщо сік рослини не містить цей вірус, то суміш залишиться рівномірно мутною, а якщо містить – то в результаті реакції антигена і антитіла утвориться пластівцеподібний осад – преципітат. За інтенсивністю випадання осаду можна визначити відносний кількісний вміст вірусу в соку рослини.
Метод рослин-індикаторів
Цей метод ґрунтується на використанні видів рослин, які реагують на зараження вірусами добре помітними, певною мірою специфічними симптомами. Його можна застосовувати до всіх відомих вірусів, що уражують культурні рослини.
Набір індикаторних видів рослин залежить від виду збудника. Віруси з широким колом рослин-господарів, наприклад ВТМ, вірус огіркової мозаїки 1, вірус мозаїки люцерни та ін. діагностують на багатьох індикаторах. У той же час, деякі вузькоспеціалізовані збудники, наприклад вірус огіркової мозаїки 2, вірус мозаїки вівса, вірус крапчастості суниці можуть заражати рослини лише однієї ботанічної родини або навіть одного роду.
Пошуки та виявлення зручних і надійних рослин індикаторів тривають, тому їхній список безперервно поповнюється. Основні вимоги до таких рослин наступні:
висока сприйнятливість до діагностованого збудника;
короткий інкубаційний період;
добре помітні, бажано специфічні для даного збудника симптоми ураження.
Індикаторний метод найчутливіший при діагностиці вірусів, однак потребує значних затрат на вирощування рослин-індикаторів. На практиці використовують зараження окремих листків-індикаторів, що реагують на віруси локальними некрозами. Ці листки поміщують у вологі камери з певними температурним режимом і освітленням.
Метод електронної мікроскопії
При дослідженні вірусів найчастіше використовують електронний мікроскоп просвічую чого типу, в якому потік електронів проходить через спеціально підготовлений зразок, а потім реєструється.
При діагностиці фітовірусів під електронним мікроскопом встановлюють форму і розмір вібріонів, а на основі цих показників ідентифікують вірус.
Метод внутрішньоклітинних включень
Деякі вірусні інфекції супроводжуються утворенням в клітинах специфічних відкладень – включень. Вони видимі під світловим мікроскопом, локалізуються здебільшого в клітинах паренхіми листків і стебел, можуть мати форму паракристалів (голки, ромби), ниток, аморфних тіл.
Кожному вірусу притаманна певна форма клітинних включень. Наприклад, ВТМ виявляють у клітинах стиглих плодів томатів у вигляді безбарвних голчастих паракристалів. Вірус огіркової мозаїки 2 утворює паракристали у вигляді коротких голок або аморфних включень, вірус жовтухи буряка – ниткоподібні або стрічкоподібні включення тощо.
Для зручності внутрішньоклітинні включення забарвлюють фуксином. при цьому включення. що складаються в основному із вірусного білка, набувають червоно-фіолетового забарвлення.