Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Березов doc.doc
Скачиваний:
0
Добавлен:
01.05.2025
Размер:
7.11 Mб
Скачать

Глава 9 биомембраны и биоэнергетика

ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ОРГАНИЗАЦИИ БИОМЕМБРАН

Все клетки отграничены друг от друга и от окружающей среды с помощью специальной оболочки-клеточной мембраны. Со времен К. Негели, опи­савшего в 1855 г. структуру мембран, окружающих живые клетки, пред­ставления об устройстве и функциях мембран существенно обогатились. Клеточная мембрана во многом определяет свойства, поведение и даже форму клетки. Мембраны прокариот и эукариот различаются между собой по составу и свойствам. Растительные и животные клетки также отличаются друг от друга как по набору органелл, так и по свойствам мембран (рис. 9.1).

Состав и строение биологических мембран. Биологические мембраны состоят из белков и липидов. Углеводы присутствуют лишь в качестве составных частей сложных белков (гликопротеинов) и сложных липидов (гликолипидов). Нуклеиновые кислоты в небольшом количестве бывают ассоциированы с мембранами, но в состав мембранных структур не включаются. Вода составляет 20% от мембранного материала, а отноше­ние белок/липид в зависимости от вида мембран колеблется от 0,25 (клетки миелиновой оболочки) до 3,0 (митохондриальные мембраны).

Лнпиды мембран представлены четырьмя основными группами: фосфо-липидами (основная доля), сфинголипидами, гликолипидами и стероидами. Фосфолипиды-это сложные эфиры фосфатидной кислоты. Основными фосфолипидами являются фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фос-фатидилинозит и фосфатидилхолин. В состав фосфолипидов входят также дифосфатидилглицерины (кардиолипин), плазмалогены (1-О-алкенил-2-О ацилфосфолипиды) и диольные фосфолипиды. Сфинголипиды, которые являются производными церамида и монофосфорных эфиров различных спиртов, представлены в основном сфингомиелином. Гликолипиды-глико-зильные производные церамида —представлены как нейтральными церебро-зидами, так и их кислыми сульфоэфирами — сульфатидами. Производные церамида и нейраминовой кислоты-ганглиозиды-часто выделяют в от­дельную группу липидов - гликосфинголипиды. Стероиды представлены холестерином (в мембранах животных клеток), ситостерином (в раститель­ных клетках) и тетрахименином (обнаружен у тетрахимены).

Несмотря на различия в составе, все мембранные липиды построены по единому плану и легко смешиваются друг с другом, образуя монослойные или бислойные структуры (рис. 9.2). В этих структурах реализуется 2 типа взаимодействий: ионные взаимодействия полярных «голов» и гидрофобные взаимодействия жирнокислотных цепей. Благодаря этому мицеллы и липо-сомы, создаваемые протяженными бислойными структурами, достаточно стабильны в водном окружении.

В наружных (плазматических) мембранах животных клеток обнаружива­ется большое количество холестерина (около 21 моль%), меньше —фос-

298

Рис. 9.1. Схематическое изображение животной (слева) и растительной (справа) клетки.

фатидилэтаноламина и еще меньше фосфатидилхолина. Для внутриклеточ­ных мембран основным компонентом является фосфатидилхолин, и соотно­шение фосфатидилхолин/фосфатидилэтаноламин в них воегда больше 1.

Соотношение основных классов липидов мембран нейронов у различных животных почти не подвержено изменениям. По-видимому, это соотноше­ние сформировалось на самых ранних стадиях эволюции и обеспечивает как стабильность липидного бислоя, так и возможность включения в него белковых молекул. В то же время жирнокислотные компоненты мембран­ных липидов сильно подвержены эволюционной и оезонной изменчивости.

Жирные кислоты, составляющие «хвост» липидных молекул, представ­лены насыщенными [от лауриновой (С12) до лигноцериновой (С24)] и нена­сыщенными (мононенасыщенные пальмитоолеиновая и олеиновая; полине­насыщенные линолевая, линоленовая, арахидоновая) кислотами. У высших растений преобладают пальмитиновая, олеиновая и линолевая кислоты, а стеариновая почти не обнаруживается; в ряде случаев выявляются оксикислоты. В мембранах животных клеток, кроме пальмитиновой и олеи­новой, много стеариновой кислоты и больше высокомолекулярных жирных кислот (содержат 20-24 углеродных фрагмента). Жирные кислоты, как

299

Рис. 9.2 Химичес кие форм\пы pv пространенных липидов биологических мембран 1 -фосфшщилэпночшин 2 фафшщилсерин; 3-фосфатидилинозит; 4-фосфатидилхолш 5-кардиотшшш 6 с фингомиспин " цсрсброзид; 8-холестерин; 9-расположение молекул) холестерин! мсад\ дв\мя мопскмши фосфолипидов: а-наименее упорядоченная облает бислоя, о оотсть упорядочив №М1я песте рином, в-область полярных «голов». Красные

правило, имеют четное число атомов углерода, но у цереброзидов и ган-глиозидов встречаются и нечетные углеводородные остовы. У бактерий полнненасыщенные жирные кислоты практически отсутствуют, но часто имеются разветвленные окси- и циклопропансодержащие кислоты. Для мембран термоацидофилышх, галофильных и метанообразующих архебак-терий характерно наличие нетипичных липидов, содержащих изопреноид-

300

Рис. 9.3. Распределение липидов между наружной (а) и внутренней (б) сторонами бислоя в мембранах эритроцитов (I), вируса гриппа (II) и с ар ко плазматического ретикулума кролика (III).

Фл-обищефосфолипвды; Фх-фосфатидилхолин; Фэ-фосфатидилэтаноламин; Фс-фосфати-дилсерин; См-офингомиелин; Фи-фоофатвдилинозит.

ные цепи, метальные концы которых соединены друг с другом ковалент-ными связями. Такие «шпильки» обеспечивают повышенную прочность липидного бислоя. (Подробнее о жирных кислотах см. главу 11.)

Липиды в составе бислоя распределяются асимметрично. Это свойство диктуется особенностями строения их молекул: фосфатидилхолину, фосфат-идилсерину, сфингомиелину присуща цилиндрическая форма, фосфатидил-этаноламину-форма конуса, а лизофосфолипидам (получаются в резуль­тате отщепления от молекулы одной жирнокислотной цепи)-форма пере­вернутого конуса. Природные мембраны также обладают исходной асим­метрией (рис. 9.3).

Белки взаимодействуют с мембранным бислоем, в результате чего они либо ассоциируются с поверхностью мембраны - периферические белки, либо пересекают бислой один или несколько раз, прочно ннтегрируясь в него,- это интегральные белки. Интеграция оказывается возможной, если в первичной структуре белка имеются достаточно протяженные участки, содержащие гидрофобные аминокислотные последовательности. В таком случае белковые молекулы способны самопроизвольно встраиваться в би­слой. При ассоциации рибосом с мембранными структурами встраивание гидрофобных белков в мембрану осуществляется синхронно с их синтезом при участии специальных механизмов, потребляющих энергию АТФ.

Участки белка, которые обращены во внеклеточную среду, могут под­вергаться гликозилированию. В мембранах растений и бактерий полисахара играют самостоятельную роль, образуя наружную оболочку. В клетках животных, в которых наружный слой включает углеводы, имеется внутрен­ний цитоскелет, состоящий из актина и других легко полимеризующихся белков; он имеет регулярную связь с мембранными белками и выполняет формообразующую и опорную функцию (рис. 9.4).

Фазовое состояние мембранных липидов. Мембранные липиды могут находиться в нескольких фазовых состояниях, т. е. они обладают мезомор-физмом. Два основных ламеллярных состояния, характерных для мембран­ных липидов в клеточных системах: кристаллическое и жидкокристалличе­ское-различаются плотностью упаковки и подвижностью находящихся в бислое белковых молекул. При более плотной упаковке ацильные цепи

Рис. 9.4. Схематическое изображение клеточной мембраны.

липидов расположены под углом, близким к 90°, и все С—С-связи нахо­дятся в трйнс-конформации (максимально вытянуты). Фазовый переход приводит к увеличению подвижности ацильных цепей в бислое, увеличению угла их наклона и уменьшению плотности упаковки. Латеральная подвиж­ность мембранных белков после фазового перехода возрастает, увеличива­ется вероятность образования их ассоциатов.

В липидном бислое могут также образовываться гексагональные струк­туры (вывернутые мицеллы). При их образовании в мембране возникают дефекты регулярной упаковки, что позволяет проникать через мембрану крупным молекулам, а также обеспечивает обмен компонентами монослоев в бислойной мембране.

Фазовые переходы мембранных липидов могут быть вызваны изменени­ем температуры среды. Значение температуры, при котором наблюдается фазовый переход, называется критической температурой фазового перехода, или разделения фаз, если различные участки мембраны вследствие гетеро­генности липидного состава по-разному отвечают на изменения темпера­туры. Ионы Саг+, изменение числа ненасыщенных жирнокислотных цепей мембранных фосфолипидов и некоторые другие факторы также могут индуцировать фазовые переходы в бислое. Обычно критическая температу­ра фазовых переходов приближена к температуре тела гомойотермных животных (или к температуре среды обитания пойкилотермных животных). Таким образом, достаточно незначительного изменения условий, чтобы изменить упаковку мембраны.

Специфические свойства биологических мембран. Благодаря указанным особенностям биологические мембраны имеют присущие им характерные черты. Они образуют протяженные бислойные структуры малой толщины (6-10 им), объединяющие белковые и липидные компоненты с различными свойствами.

Целостная структура мембраны создается за счет гидрофобных и элект­ростатических взаимодействий, а не за счет ковалентных связей между составляющими ее молекулами белков и липидов. Гидрофобный липидный бислой представляет естественную преграду для проникновения полярных молекул. Мембраны асимметричны по своему исходному строеняю, что

302

обеспечивает градиент кривизны и спонтанное образование замкнутых структур.

Мембранный бислой обладает относительно малой микровязкостью. Другими словами, мембраны рыхло упакованы, что позволяет отдельным компонентам проявлять высокую подвижность в латеральном направ­лении.

Наружные мембраны клеток отличаются от внутренних по липидному составу (последние почти не содержат стеринов, имеют соотношение ФХ/ФЭ > 1) и обладают специфическим набором ферментов и рецепторов. Как правило, белки плазматических мембран со стороны внеклеточной среды обильно гликозилированы. Внутриклеточные мембраны содержат мало гликопротеинов и гликолипидов и характеризуются меньшей микро­вязкостью. Благодаря этому они могут образовывать органеллы малого размера. Мембранные белки выполняют различные специфические функ­ции: рецепторные, транспортные, ферментативные, энергопреобразующие и т.д. (см. далее).

Функции биологических мембран. Как отмечалось, клеточные мембраны отграничивают содержимое клетки (или клеточной органеллы) от окружаю­щей среды. Благодаря наличию специальных рецепторов они воспринима­ют сигналы из внешней среды (например, молекулы гормонов, называемые первичными мессенджерамн, или посредниками), в ответ на которые образу­ются вторичные мессенджеры, высвобождающиеся внутрь клетки. Так осу­ществляется преобразование сигналов, изменяющих клеточный метаболизм в соответствии с изменяющимися условиями среды (см. главу 8).

Мембранные рецепторы выполняют функции узнавания (иммунокомпе-тентная система), адгезии (обеспечение межклеточных контактов, формиро­вание тканей), регуляции активности ионных каналов (электрическая возбу­димость, создание мембранного потенциала). Мембранные ферменты в со­ставе бислоя приобретают большую стабильность и способность к осуще­ствлению реакций, которые в гидрофильном окружении протекали бы с весьма малой скоростью. Липидное окружение предоставляет таким белкам «привилегированные» условия функционирования, но и накладыва­ет ограничения на поведение белковых ассоциатов: последнее сильно зависит от плотности упаковки (микровязкости) мембран. Поэтому факто­ры, влияющие на липидный состав и свойства клеточной мембраны, оказывают регулирующее влияние на функции мембранных белков.

Мембранные белки часто образуют олнгомерные ансамбли, взаимодей­ствия между которыми (или длительность их существования в бислое) оказывается под контролем их мембранного окружения. Изменения микро­вязкости мембран в таком случае позволяют контролировать активность этих надмолекулярных структур.

Транспортная функция является одной из важных функций клеточных мембран (рис. 9.5). Мембрана создает существенные ограничения для проникновения различ­ных веществ, однако она не является полностью непроницаемой: небольшие нейтральные молекулы могут проникать через бислой в области структурных дефектов. Этот процесс осуществляется по градиенту концентрации переносимого вещества-из области, где его содержание высоко, в область с более низким содержанием. Такой процесс называется простой диффузией, он осуществляется не избирательно и с низкой скоростью.

При облегченной днффузнн вещества также переносятся в направлении их концентрационного градиента, но с использованием специальных структур - пере­носчиков или каналов, увеличивающих скорость и специфичность переноса. Извест-

303

;::§::

1 Котрэнспорт '

Рис. 9.5. Перенос веществ через мембрану.

а-виды переноса, б-пассивный и активный транспорт 1 - пассивная диффузия, 2-диффузия

н ы высокоспецифические транслоказы белковые молекулы, переносящие аденило-вые нуклеотиды через внутреннюю мембрану митохондрий: Na+/Ca!+-обмен ник -белок, входящий в состав плазматических мембран многих клеток; низкомолекуляр­ный пептид бактериального происхождения валиномицин-специфический перенос­чик для ионов К+.

Облегченная диффузия, осуществляемая с помощью каналов, не обладает высо­кой специфичностью (специфичность определяется лишь размерами канала), но протекает с большей скоростью, а процесс переноса не достигает насыщения в широком диапазоне концентраций переносимого вещества. Функционирование

нирование переносчиков. Все эти примеры относятся к пассивному транспорту через мембрану.

Активный транспорт веществ осуществляется такими же механизмами, но проте­кает против концентрационного градиента и для своего осуществления должен быть сопряжен с энергодающим процессом. Основным источником энергии для активно­го транспорта является АТФ. Поэтому, как правило, эти системы представляют собой АТФазы. Примером систем активного транспорта ионов является Na+/K+-АТФаза плазматических мембран животных клеток, которая «выкачивает» из клетки ионы натрия в обмен на ионы калия, затрачивая на выполнение этой работы АТФ в стехиометрии Ша+/2К+/1АТФ. Саг+-АТФаза осуществляет активный транспорт кальция через мембрану со стехиометрией 2Саг+/1АТФ.

работающие как Н+-АТФазы. В результате их функционирования на мембране

возникает разность концентраций протонов (ДрН) и разность электрических потен­циалов, в совокупности образующие протонный электрохимический потенциал, обозначаемый ДцН+ (см. далее). За счет работы Н+-АТФазы создается кислая среда в некоторых органеллах клетки (например, лизосомах, хромаффинных клетках надпочечников). В митохондриальной мембране Н+-АТФаза работает в обратном направлении, используя ДцН+, создаваемый в дыхательной цепи, для образования АТФ.

Наконец, в клетках широко представлен вторично-активный транспорт, в процессе которого градиент одного вещества используется для транспорта другого. С по­мощью вторично-активного транспорта клетки аккумулируют сахара, аминокисло­ты и выводят некоторые продукты метаболизма, используя градиент Na+, созда­ваемый в ходе работы Na+/K+-ATOa3bi (см. рис. 9.5).

БИОЭНЕРГЕТИКА

С позиций термодинамики (см. главу 4) метаболизм представляет собой совокупность процессов, в которой реакции, потребляющие энергию из внешней среды (эндэргонические), сопрягаются с энергодающими (экзэрго-ническими) реакциями, что позволяет живым существам оказывать посто­янное сопротивление нарастанию энтропии. Выяснение биохимических механизмов, приводящих к генерации различных форм биологической энергии, является предметом биоэнергетики. Источником энергии служат реакции, в ходе которых соединения, содержащие атомы углерода в высо-ковосстановленном состоянии, подвергаются окислению, а специальные дыхательные переносчики присоединяют протоны и электроны (восстанав­ливаются) и в таком виде транспортируют атомы водорода к дыхательной цепи.

Биологические виды энергии. Энергетические превращения в живой клет­ке подразделяют на две группы: локализованные в мембранах и протекаю­щие в цитоплазме. В каждом случае для «оплаты» энергетических затрат используется своя «валюта»: в мембране это ДцН+ или A^Na+, а в цито­плазме—АТФ, креатинфосфат и другие макроэргические соединения. Не­посредственным источником АТФ являются процессы субстратного и окис­лительного фосфорилирования. Процессы субстратного фосфорилирования наблюдаются при гликолизе и на одной из стадий цикла трикарбоновых кислот (реакция сукцинил-КоА —> сукцинат; см. главу 10). Генерация ДцН+ и Д ц N а , используемых для окислительного фосфорилирования, осуществ­ляется в процессе транспорта электронов в дыхательной цепн энергосопря-гающих мембран.

Энергия разности потенциалов на сопрягающих мембранах может обратимо превращаться в энергию АТФ. Эти процессы катализируются Н+-АТФ-синтазой в мембранах, генерирующих протонный потенциал, или Ка+-АТФ-синтазой (Ка+-АТФазой) в «натриевых мембранах» алкалофиль-ных бактерий, поддерживающих Д^Ша+ [Скулачев В.П., 1989]. На рис. 9-6 представлена схема энергетики живых клеток, использующих ДцН+ в каче­стве мембранной формы конвертируемой энергии. На схеме видно, что свет или энергия субстратов дыхания утилизируется ферментами фотосинтети­ческой или дыхательной редокс-цепи (у галобактерий-бактериородопси-ном). Генерируемый потенциал используется для совершения полезной работы, в частности для образования АТФ. Будучи макроэргическим соединением, АТФ выполнняет функцию аккумулирования биологической энергии и ее последующего использования для выполнения клеточных функций. «Макроэргичность» АТФ объясняется рядом особенностей его

305

[ БэетериородопС!

вет|

[ Редокс-цепи|

|_ТрэнСгидрогенэ:

т

[Тепло]*

•|Ыа-градиент|

работа \" работа

| работа |

Ир]

■[Креэтинфосфэт

1 работа

у"

I

' работа ]

Субстратное ;форилировэ|-

ние '

Рис. 9-6. Взаимозаменяемость различных видов биологической энергии при выпол­нении клеточной работы [Скулачев В.П., 1989].

Красной стрелкой показана взаимозаменяемость в клетке двух клеточных видов энергии-АТФ и ДцН+, для которых имеются также специальные буферные системы: креатинфосфат для АТФ

молекулы. Это прежде всего высокая плотность зарядов, сконцентрирован­ная в «хвосте» молекулы, обеспечивающая легкость диссоциации терми­нального фосфата при водном гидролизе. Продукты этого гидролиза представляют собой АДФ и неорганический фосфат и далее-АМФ и неор­ганический фосфат. Это обеспечивает высокую величину свободной энергии гидролиза терминального фосфата АТФ в водной среде.

Тканевое дыхание и биологическое окисление. Распад органических соеди­нений в живых тканях, сопровождающийся потреблением молекулярного кислорода и приводящий к выделению углекислого газа и воды и образова­нию биологических видов энергии, называется тканевым дыханием. Ткане­вое дыхание представляют как конечный этап пути превращений моносаха-ров (в основном глюкозы) до указанных конечных продуктов, в который на разных стадиях включаются другие сахара и их производные, а также промежуточные продукты распада липидов (жирные кислоты), белков (аминокислоты) и нуклеиновых оснований. Итоговая реакция тканевого дыхания будет выглядеть следующим образом:

С6Н12О6 + 6О2 = 6СО2 + 6Н2О + 2780 кДж/моль.

(1)

Впервые сущность дыхания объяснил А.-Л. Лавуазье (1743-1794), обративший внимание на сходство между горением органических веществ вне организма и дыха­нием животных. Постепенно становились ясными принципиальные различия между этими двумя процессами: в организме окисление протекает при относительно низкой температуре в присутствии воды, и его скорость регулируется обменом веществ. В настоящее время биологическое окисление определяется как совокупность реакций окисления субстратов в живых клетках, основная функция которых- энерге-

306

тическое обеспечение метаболизма. В развитие концепций биологического окисле­ния в XX в. важнейший вклад внесли А.Н. Бах, О. Варбург, Г. Крепе, В.А. Энгель-гардт, В.И. Палладии, В.А. Белицер, СЕ. Северин, В.П. Скулачев.

Потребление кислорода тканями зависит от интенсивности реакций тканевого дыхания. Наибольшей скоростью тканевого дыхания характери­зуются почки, мозг, печень, наименьшей-кожа, мышечная ткань (в покое). Уравнение (2) описывает суммарный результат многоступенчатого процес­са, приводящего к образованию молочной кислоты (см. главу 10) и проте­кающего без участия кислорода:

+ 65 кДж/моль.

(2)

Этот путь отражает, по-видимому, энергетическое обеспечение простей­ших форм жизни, функционировавших в бескислородных условиях. Совре­менные анаэробные микроорганизмы (осуществляющие молочнокислое, спиртовое и уксуснокислое брожение) получают для жизнедеятельности энергию, производимую в процессе гликолиза или его модификаций.

гамид ад ениндинукл е о ti фосфат (НЙДФ+)

Использование клетками кислорода открывает возможности для более полного окисления субстратов. В аэробных условиях продукты бескисло­родного окисления становятся субстратами цикла трикарбоновых кислот (см. главу 10), в ходе которого образуются восстановленные дыхательные переносчики НАДФН, НАДН и флавнновые коферменты. Способность НАД+ и НАДФ+ играть роль промежуточного переносчика водорода связана с наличием в их структуре амида никотиновой кислоты. При взаимодействнн этих кофакторов с атомами водорода имеет место обрати­мое гидрированне (присоединение атомов водорода):

НАД+ НАДН

При этом в молекулу НАД+ (НАД Ф+) включаются 2 электрона и одни протон, а второй протон остается в среде.

Во флавиновых коферментах (ФАД или ФМН), активной частью моле­кул которых является изоаллоксазнновое кольцо, в результате восстанов­ления чаще всего наблюдается присоединение 2 протонов и 2 электронов одновременно:

НДДН + Н+ + флавиновый фермент - =^ НДД+ + Флавиновь1й ферм(

(ФМН) (ФМНН;)

Н [

Восстановленные формы этих кофакторов способны транспортировать водород и электроны к дыхательной цепи митохондрий или иных энерго-сопрягаюших мембран (см. далее).

Организация и функционирование дыхательной цепи. В клетках эукариот дыхательная цепь расположена во внутренней мембране митохондрий, у дышащих бактерий—в цитоплазматической мембране и специализирован­ных структурах-мезосомах, или тилакоидах. Компоненты дыхательной цепи митохондрий в порядке убывания окислительно-восстанови тельного потенциала можно расположить, как показано в табл. 9-1.

Таблица 9.1. Окисштеньно-восстановитеиьныи потенциаи компонентов дыхатель­ной цепи в стандартных >стювпях (кониентрапия компонентов 1М, рН 7,25°С)

Восстановлении J tin

LII Л'ННН

1

tin

F, В

НАДН + Н

НАД+

-0,32

ФАДН,

ФА1Г

-0,05

Убихинол

(KoQ-H,)

Убихинон

0,04

Цитохром

Цитохром Ь

F

^)

0,07

F

е )

0,23

»

с (Fe3+)

» с

F

е )

1- 0,25

a (Fe!+)

» а

F

е )

ь 0 29

* аг

(Fe!+)

а3

F

е3+)

Н0.55

нго

'/Л

+ 0,82

Молярные соотношения компонентов дыхательной цепи являются постоянными, ее компоненты встроены в митохоидриальную мембрану в виде 4 бел ко во -лип ид ных комплексов: НАДН-КоО^-редуктаза (комплекс I), сукцинат-Кор-редуктаза (комп­лекс II), KoQH,-цитохром с-редуктаза (комплекс III) и цитохром а- цитохром о кси-даза (комплекс IV) (рис. 9-7).

Если субстратом окисления служат а-кетокислоты, в переносе электронов на НАД? участвуют липоатсодержащие дегидрогеназы. В случае окисления пролина, глутамата, изоцнтрата и других субстратов перенос электронов происходит непос­редственно на НАД"1". Восстановленный НАД в дыхательной цепи окисляется НАДН-дегидрогеназой, содержащей железосерный белок (FeS) и ФМН и прочно связанной с дыхательной цепью.

309

пгдыхате

юй и

[ производ-э представ-

KoQ (убихинон), необходимый компоне лм бензохинонас боковой цепью, котора ;на 10 изопреноидными единицами (см. г

у млекопитающих чг

1ву 7). Как любой хинон, KoQ с

тов, поставляемых в дыхательную цепь через флавиновые дегидрогеназы. Содержа­ние его значительно превосходит содержание других компонентов дыхательной цепи.

Дополнительным участником дыхательной цепи является железосерный белок FeS {негемовое железо). Он участвует в окислительно-восстановительном процессе, протекающем по одноэлектронному типу. Первый участок локализации FeS нахо­дится между ФМН и KoQ, второй- между цитохромами b и cv Это соответствует тому факту, что со стадии ФМН путь протонов и электронов разделяется: первые накапливаются в митохоидриальном матриксе, а вторые идут на гидрофобные переносчики- KoQ и цитохромы.

Цитохромы в дыхательной цепи выстроены в порядке возрастания окислительно-восстановительного потенциала. Они представляют собой гемопротеины, в которых простетическая геминовая группа близка к гему гемоглобина (у цитохрома b иден­тична). Ионы железа в составе гема при получении и отдаче электронов обратимо изменяют свою валентность.

В процессах тканевого дыхания наиболее важную роль играют цитохро­мы Ь, си с, а и аъ. Цитохром аъ представляет собой терминальный участок дыхательной цепи-цитохромоксидазу, которая осуществляет окисление цитохрома с и образование воды. Элементарный акт представляет собой двухэлектронное восстановление одного атома кислорода, т.е. каждая молекула кислорода одновременно взаимодействует с двумя электрон-транспортными цепями. При транспорте каждой пары электронов во внутримитохондриальном пространстве может накапливаться до 6 прото­нов (рис. 9-8).

Строение дыхательной цепи интенсивно исследуется. В числе послед­них достижений молекулярной биохимии-установление тонкой структу-

310

Рис. 9.8. Механизм обра­зования АТФ согласно хе-миосмотической гипотезе. R-субстраты-доноры водо-

ры дыхательных ферментов с помощью рентгеноструктурного анализа. С помощью электронного микроскопа с наивысшим доступным в настоя­щее время разрешением можно «увидеть» структуру цитохромоксидазы (рис. 9.9).

Окислительное фосфорилирование и дыхательный контроль. Функция дыхательной цепи-утилизация восстановленных дыхательных переносчи­ков, образующихся в реакциях метаболического окисления субстратов (главным образом в цикле трикарбоновых кислот). Каждая окислительная реакция в соответствии с величиной высвобождаемой энергии «обслужива­ется» соответствующим дыхательным переносчиком: НАДФ, НАД или ФАД. Соответственно своим окислительно-восстановительным потенциа­лам эти соединения в восстановленной форме подключаются к дыхательной цепи (см. рис. 9-7). В дыхательной цепи происходит дискриминация прото­нов и электронов: в то время как протоны переносятся через мембрану, создавая ДрН, электроны движутся по цепи переносчиков от убихннола к цитохромоксидазе, генерируя разность электрических потенциалов, необ­ходимую для образования АТФ протонной АТФ-сннтазой. Таким образом, тканевое дыхание «заряжает» митохондриальную мембрану, а окисли­тельное фосфорилирование «разряжает» ее.

Разность электрических потенциалов на митохондриальной мембране, создавае­мая дыхательной цепью, которая выступает в качестве молекулярного проводника электронов, является движущей силой для образования АТФ и других видов полезной биологической энергии (см. рис. 9.6). Механизмы этих превращений описываетхемиосмотическая концепция превращения энергии в живых клетках. Она была выдвинута П. Митчеллом в 1960 г. для объяснения молекулярного механизма

311

Рис. 9-9- Схематическое изображение цитохромоксидазы с разрешением 05 нм (а) иееактивногоцентрасразрешением2,8нм(б) [Tsukiharaetal,Science.-1966.-Vol. 269.- P. 1069] (Печатается с любезного разрешения редакции журнала).

сопряжения транспорта электронов и образования АТФ в дыхательной цепи и быстро получила международное признание. За развитие исследований в обла­сти биоэнергетики П. Митчеллу в 1978 г. была присуждена Нобелевская премия. В 199? г. П. Бойеру и Дж. Уокеру была присуждена Нобелевская премия за выяснение молекулярных механизмов действия главного фермента биоэнергетики-протонной АТФ-синтазы.

Согласно хемиосмотической концепции, движение электронов по дыха­тельной цепи является источником энергии для транслокации протонов через митохоидриальную мембрану. Возникающая при этом разность электрохимических потенциалов (ДдН+) приводит в действие АТФ-синтазу, катализирующую реакцию

АДФ+Р, = АТФ.

(3)

В дыхательной цепи есть только 3 участка, где перенос электронов сопряжен с накоплением энергии, достаточным для образования АТФ (см. рис. 9.7), на других этапах возникающая разность потенциалов для этого процесса недостаточна. Максимальная величина коэффициента фосфорили-рования, таким образом, составляет 3, если реакция окисления идет с участием НАД, и 2, если окисление субстрата протекает через флавиновые дегидрогеназы. Теоретически еще одну молекулу АТФ можно получить в трансгидрогеназной реакции (если процесс начинается с восстановленного НАДФ):

НАДФН + НАД+ = НАДФ+ + НАДН + 30 кДж/моль.

(4)

Обычно в тканях восстановленный НАДФ используется в пластическом обмене, обеспечивая разнообразные синтетические процессы, так что равно­весие трансгидрогеназной реакции сильно сдвинуто влево.

Эффективность окислительного фосфор ил ирования в митохондриях определяет­ся как отношение величины образовавшегося АТФ к поглощенному кислороду: АТФ/О или Р/О (коэффициент фосфорилирования). Экспериментально определяе­мые значения Р/О, как правило, оказываются меньше 3. Это свидетельствует о том, что процесс дыхания не полностью сопряжен с фосфор ил ированием. Действительно, окислительное фосфорилирование в отличие от субстратного не является процессом, в котором окисление жестко сопряжено с образованием макроэргов. Степень сопряжения зависит главным образом от целостности митохондриальной мембра­ны, сберегающей разность потенциалов, создаваемую транспортом электронов. По этой причине соединения, обеспечивающие протонную проводимость (как 2,4-ди-нитрофенол), являются разобщителями.

Несопряженное дыхание (свободное окисление) выполняет важные биологические функции. Оно обеспечивает поддержание температуры тела на более высоком уровне, чем температура окружающей среды. В процессе эволюции у гомойотерм-ныхживотныхичеловека сформировались специальные ткани (бурыйжир), функци­ей которых является поддержание постоянной высокой температуры тела за счет регулируемого разобщения окисления и фосфорилирования в митохондриальной дыхательной цепи. Процесс разобщения контролируется гормонами.

В норме скорость митохондриального транспорта электронов регулируется содержанием АДФ. Выполнение клеткой функций с затратой АТФ приводит к накоплению АДФ, который в свою очередь активирует тканевое дыхание. Таким образом, клеткам свойственно реагировать на интенсивность клеточного метабо­лизма и поддерживать запасы АТФ на необходимом уровне. Это свойство называет­ся дыхательным контролем.

За сутки человек потребляет около 550 л (24,75 моля) кислорода. Если считать, что в тканевом дыхании за этот период восстанавливается 40 г атомов кислорода (20 молей), а величину Р/О принять за 2,5, то в митохондриях должно синтезиро­ваться 100 молей, или около 50 кг АТФ! При этом часть энергии окисления субстратов расходуется на совершение полезной работы, не превращаясь в АТФ (см. рис. 9.6).

Приведенные данные показывают, как важно организму поддержание процессов жизнедеятельности.

Свободное окисление. Одна из задач свободного (несопряженного) окис­ления—превращения природных или неприродных субстратов, называемых в этом случае ксенобиотиками (ксено —несовместимый, биос—жизнь). Они осуществляются ферментами днокснгеназамн и моноокснгеназамн. Окисле­ние протекает при участии специализированных цитохромов, локализован­ных чаще всего в эндоплазматическом ретикулуме, поэтому иногда этот процесс называют мнкросомальным окислением [Арчаков А.И., 1975].

В реакциях свободного окисления участвуют также кислород и восста­новленные дыхательные переносчики (чаще всего НАДФН). Акцептором электронов является цитохром Р-450 (иногда цитохром Ь5). Окисление субстрата протекает по следующей схеме:

SH+O2->SOH. (5)

Механизм действия оксигеназ включает изменение валентности входящих в их состав ионов двухвалентных металлов (железа или меди). Диоксигеназы присоеди­няют к субстрату молекулярный кислород, активируя его за счет электрона атома

313

железа в активном центре (железо при этом становится трехвалентнвш). Оксигена-ция протекает как атака субстрата образующимся супероксид-анионом кислорода. Одной из биологически важных реакций такого типа является превращение р-каро­тина в витамин А. Монооксигеназв1 требуют участия в реакции НАДФН, атомв1 водорода которого взаимодействуют с одним из атомов кислорода, посколвку толвко один электрон связывается с субстратом. К широко распространенным монооксигеназам относятся разнообразные гидроксилазы. Они принимают участие в окислении аминокислот, оксикислот, полиизопреноидрв.

В процессе свободного окисления вследствие особенностей используе­мых цепей передачи электронов не происходит образования АТФ; биологи­ческая роль этих процессов заключается в метаболизме ряда природных и ксенобиотических субстратов. В последнем случае свободное окисление выполняет важную функцию модификации чужеродных соединений. К по­следним относятся лекарственные средства, гербициды, продукты загряз­нения окружающей среды, в возрастающем количестве попадающие в орга­низм с водой, пищей и атмосферным воздухом. Как правило, они имеют гидрофобные свойства. Многие из них являются канцерогенными. Их гидроксилирование в ходе свободного окисления облегчает последующую деструкцию и выведение из организма (см. главу 12 и 13).

ГЕНЕРАЦИЯ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ В КЛЕТКЕ

Свободное окисление протекает при участии свободнорадикальных форм кислорода, которые образуются в процессе одноэлектронного восстановле­ния кислорода и прежде всего супероксид-аннона кислорода.

Обычно эти реакции своднорадикального окисления протекают в актив­ном центре соответствующих ферментов, а промежуточные продукты не появляются во внешней среде. При изменении условий функционирования дыхательной цепи (например, при гипоксии) в ней также возможно одно-электронное восстановление кислорода, объясняющееся тем, что его срод­ство к убихинону выше, чем к цитохромоксидазе. Эти процессы приводят к образованию супероксид-аниона кислорода. Этот радикал может образо­вываться и под влиянием ультрафиолетовых лучей, а также путем взаимо­действия кислорода с ионами металлов переменной валентности (чаще всего с железом) или в ходе спонтанного окисления некоторых соединений, например дофамина. Наконец, он может продуцироваться в клетках и таки­ми ферментами, как ксантиноксидаза или НАДФН-оксидаза.

Образование супероксид-аниона кислорода имеет важное биологическое значение. Он является высокореакционным соединением, которое вследст­вие высокой гидрофильности не может покидать клетку и накапливается в цитоплазме. Его превращения приводят к образованию ряда активных окислителей (рис. 9.10). Он способен активировать NO-синтазу, которая образует в тканях NO-радикал, обладающий свойствами вторичного по­средника (активирует растворимую гуанилатциклазу, продукт которой — цГМФ—проявляет вазодилататорные свойства). С другой стороны, супер­оксид-анион способен снижать содержание NO-радикала, превращая его в пероксинитрит ONOOH (см. рис. 9.10).

Живые клетки имеют системы защиты от повышенной продукции свободных радикалов. Фермент супе роке идднсмутаза превращает супер­оксид-анион кислорода в менее реакционноспособный и более гидрофобный пероксид водорода Н2О2. Пероксид водорода является субстратом ката-лазы и глутатионзависимых пероксидаз, которые катализируют его превра-

314

Рис. 9-10. Взаимопревращения свободных радикалов и их ос­новные функции в тканях [Бол­дырев А. А., 1996].

щенне в молекулу воды. Однако пероксид водорода может генерировать гидроксил-радикал в присутствии двухвалентного железа или превращаться в гипохлорит-аннон ОСГ ферментом миелопероксидазой.

Как гипохлорит-анион, так и гидроксил-раднкал являются сильными окислителями. Они способны модифицировать белки, нуклеиновые кисло­ты, индуцировать перекисное окисление липидов (от которого наиболее сильно «страдают» полиненасыщенные мембранные липиды) и в результате цепных реакций приводить к множественным нарушениям мембран и к ги­бели клеток. Важным дополнением этих реакций является способность NO-радикала при взаимодействии с супероксид-анионом образовывать пероксинитрит, который может индуцировать так называемый апоптоз (запрограммированная гибель клеток), а в ходе своего спонтанного распада превращаться в гидроксил-радикал. Последний может образовываться также из гипохлорит-аннона в присутствии ионов железа.

Процессы, протекающие до момента образования гипохлорит-аниона или гидроксил-радикала, локализованы в цитоплазме и контролируются цитоплазматическими ферментами или природными водорастворимыми антиоксидантами. Например, таурин способен связывать гипохлорит-анион в форме хлорамннового комплекса, дипептид карнозин и его производные нейтрализуют гидроксил-радикал, а такие соединения, как белок ферритин, связывают железо. Перекисное окисление липидов, инициируемое в гидро­фобном пространстве клеточных мембран, способен прерывать широко известный гидрофобный антиоксидант а-токоферол (витамин Е). Его высо­кая концентрация в биологических мембранах препятствует их поврежде­нию свободными радикалами.

Полное подавление перекисных процессов в тканях, по-видимому, не­целесообразно, свободные радикалы обладают полезными свойствами. Они индуцируют апоптоз, участвуют в формировании клеточного иммунитета. Образование гидроперекисей жирнокислотных цепей полиненасыщенных фосфолипидов повреждает бислой и, стимулируя работу фосфолипаз, спо­собствует высвобождению жирных кислот из состава мембранных липидов. Полиненасыщенная арахидоновая кислота является обычной мишенью для

315

свободнорадикальной атаки. Этот процесс может стимулировать фермента­тивные превращения ее по одному из двух путей — липоксигеназному или циклооксигеназному. В результате в клетке образуются важные биологи­ческие регуляторы: простагландины, лейкотриены, тромбоксаны. Лизофос-фолипиды, образующиеся при отщеплении модифицированной жирной кислоты, могут быть восстановлены до исходного состояния с использова­нием другой жирной кислоты (в форме ацил-КоА). Таким образом может регулироваться жирнокислотный состав липидных молекул в клеточной мембране.

Высокореакционные свободные радикалы кислорода, характеризующие­ся высоким окислительным потенциалом и способностью к быстрым превращениям, могут индуцировать цепные реакции. В настоящее время признается важная роль свободнорадикальных процессов в развитии воз­растных и патологических состояний в тканях [Владимиров Ю.А. и др., 1983]. Свободнорадикальные превращения вовлекаются в механизмы, по­вышающие выживаемость клеток в неблагоприятных условиях, а снижение генерации свободных радикалов в организме способствует ослаблению клеточного иммунитета. Однако усиленная генерация свободных радикалов сопровождает патологические состояния (болезнь Паркинсона, Альцгейме-ра) и сам процесс биологического старения.

МЕМБРАННЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ МЕТАБОЛИЗМА

Биологические мембраны представляют собой динамическую структуру, компоненты которой подвержены быстрому метаболизму. Благодаря это­му липидное окружение мембранных белков обладает способностью в соот­ветствии с изменением условий функционирования изменять свои физико-химические свойства: упаковку, микровязкость, латеральную подвижность компонентов в бислое и т.д. Подавляющее большинство мембранных белков функционирует в составе олигомерных ансамблей, например в ды­хательной цепи митохондрий. Транспортные белки также организуют ассоциаты в бислое: димеры (Са2*-АТФаза), тетрамеры (Na+/K*-AT<J>a3a) или даже более высокоорганизованные надмолекулярные комплексы.

Примером таких комплексов являются сложные мембранные структу­ры, включающие рецепторы и преобразователи сигналов, действие которых начинается с восприятия внешнего импульса (первичного посредника) на внешней стороне клеточной мембраны и завершается образованием вторич­ного посредника на внутренней стороне мембраны. Рассмотрим передачу и трансформацию сигнала от первичного посредника, роль которого, как правило, выполняют разнообразные гормоны, не проникающие через кле­точную мембрану (см. главу 8).

Первичный посредник взаимодействует с соответствующим рецептором, что приводит к изменению конформации последнего и, как следствие, к увеличению латеральной подвижности в мембране. Это повышает вероят­ность взаимодействия активированного рецептора с преобразователем (роль преобразователей выполняют специфические мембраносвязанные белки, содержащие ГТФ в связанном состоянии,—G-белки, или ГТФ-связы-вающие белки) [Авдонин П.В., Ткачук В.А, 1994].

G-белки—центральная часть регуляторного мембранного ансамбля, представлены сложным олигомерным комплексом. Они относятся к гетеро-тримерным протеолипидам, состоящим из а-, р- и 7-субъединиц. [3-субъеди-

316

н ица комплекса тесно ассоциирована с а- и у-субъединицами. Последние модифицированы жирнокислотными радикалами-миристоильным радика­лом в случае а-субъединицы (присоединен через остаток глутаминовой кислоты) и геранилышм радикалом в случае у-субъединицы (присоединен к радикалу цистеина). Такая модификация прочно ассоциирует G-белки с мембранным бислоем. Следовательно, регуляторные белки функциониру­ют в тесной связи с мембраной, и их свойства зависят от физико-химических характеристик мембраны.

Установлено, что нарушение взаимодействия между белковыми молеку­лами в олигомерном ансамбле №++-АТФазы, происходящее, например, при ее свободиорадикальной модификации в ишемическом мозге, устраняет способность АТФ регулировать активность этого фермента.

Приведенные примеры указывают на важное биологическое значение олигомерных ассоциатов мембранных белков, состоящее в том, что при изменении физико-химических свойств мембраны соответственно изменяет­ся и характер взаимодействия мембранных структур. Таким образом формируются обратные связи для приспособления обмена веществ к по­требностям организма.

G-белки делятся на несколько типов, причем один из них выполняет стимулирующую, а остальные-ингибирующую функции. Взаимодействие соответствующего G-белка с ферментом-усилителем сигнала приводит к изменению свойств фермента и соответственно к изменению его активно­сти. В случае циклического АМФ (рис. 9-11) возможна как активация адеинлатциклазы, так и ее ингибирование (в зависимости от типа G-белков, участвующих в трансформации сигнала). Итогом будет изменение скорости синтеза цитоплазматического цАМФ-активатора протеинкиназ, регулиру­ющих функцию клеточных белков в результате их фосфорилирования. В неактивном состоянии протеинкиназа представляет собой димер из

каталитической и регуляторной субъединиц. Активация протеинкиназы обеспечивается связыванием цАМФ с регуляторной субъединицей, что вызывает диссоциацию и активацию каталитической субъединицы.

Субстратами протеинкиназ являются разнообразные белки, фосфорипи-рование которых изменяет их активность. Например, активация протеин­киназы А со стороны цАМФ приводит к фосфорипированию гликогенсин-тазы и гликогенфосфорипазы. При этом активность первого фермента подавляется, а второго усиливается (см. главу 10). Таким образом, появле­ние в кровяном русле адреналина, активирующего аденилатциклазу миоци-тов, улучшает энергетическое обеспечение сокращений сердечной мышцы.

Известно несколько типов протеинкиназ, активируемых различными эффекторами. Субстраты протеинкиназ —огромное количество белков, фос-форипирование которых приводит к изменению их активности. Более того, обнаружены протеинфосфатазы, которые, осуществляя гидролиз фосфат­ной группы, возвращают белковую молекулу в исходное состояние. Во многих случаях мишенью действия киназ являются другие киназы, которые фосфорилируют фосфатазы, в свою очередь регулируя их функцию. Таким образом, регуляция метаболизма имеет каскадный характер.