4.2.2 Электрофорез в горизонтальных агарозных гелях [75]

Под действием электрического тока фрагменты ДНК продвигаются в геле от катода к аноду ("от минуса к плюсу"), скорость их движения при этом обратно пропорциональна размерам (мелкие фрагменты проходят больший путь). Положение фрагментов в геле определяют по флуоресценции бромида этидия - интеркалирующего агента, встраивающегося между двумя цепями молекулы ДНК.

Оборудование: электрофоретическая камера, столик для заливки геля, источник постоянного тока (до 500 В), трансиллюминатор, фотокамера, оранжевый фильтр.

Реактивы: трис, борная кислота, ЭДТА, агароза, бромфеноловый синий, ксилолцианол, сахароза, бромид этидия.

Агароза для работы с ДНК должна быть очищена от примесей сульфатов, которые вызывают сдвиг фрагментов ДНК к катоду и даже могут исказить порядок их следования. О степени очистки агарозы судят по величине эндоосмоса (- mr), значение которого не должно превышать 0,15 (оно обычно указано на этикетке).

Приготовление растворов:

1) Трис – боратный буфер (0,089 М трис, 0,089 М борная кислота, 0,002 М ЭДТА).

Пятикратный буфер ТВЕ (5x) – объем 1 л:

трис 54 г;

борная кислота 27,5 г;

0,5 М ЭДТА, рН 8,0 20 мл.

Н₂О до 1 л.

Непосредственно для работы используем однократный или 0,5-кратный буфер. Соответственно концентрированный раствор разводим в 5 или 10 раз. Буфер ТВЕ можно использовать многократно.

К рабочему раствору можно добавить 0,5 мкг/мл бромида этидия (на 1 л буфера ТВЕ – 50 мкл матричного раствора бромида этидия (10 мг/мл)). Такой раствор ТВЕ лучше хранить в темноте, поскольку бромид этидия на свету разлагается. Можно также проводить разделение фрагментов в буфере без БЭ и окрашивать гели после завершения электрофореза. Кроме того, бромистый этидий можно добавлять непосредственно в расплавленную агарозу перед заливкой геля.

2) Трис – ацетатный буфер (ТАЕ) (0,04 М трис-ацетат; 0,002 М ЭДТА).

Концентрированный (50x) ТАЕ – объем 1 л:

трис 242 г

ледяная уксусная кислота 57 мл

0,5 М ЭДТА, рН 8,0 100 мл

Н₂О до 1 л

3) Буфер (6x) для нанесения проб (40 % сахарозы (вес/объем); 0,25 % бромфенолового синего; 0,25 % ксилолцианола) – конечный объем 20 мл:

сахароза 8 г

бромфеноловый синий 50 мг

ксилолцианол 50 мг

Н₂О до 20 мл.

Приготовление гелей:

Концентрация агарозы в гелях может составлять от 0,3 % до 3,5%, при выборе концентрации геля мы учитываем размеры анализируемых фрагментов и цели работы.

• Определяем концентрацию и объем будущего геля. Взвешиваем необходимое количество агарозы. Навеску помещаем в коническую термостойкую колбу с плоским дном и добавить буфер ТВЕ (1х) до требуемого объема. Конечный объем раствора должен быть не более ½ объема колбы, иначе при закипании сильно пенящаяся агароза выльется.

• Помещаем колбу в микроволновую печь и нагреваем ее до закипания раствора. Осторожно перемешиваем. Доводим до кипения раствор еще раз и даем ему остыть до температуры 55С.

• Добавляем в расплавленную агарозу бромид этидия из расчета примерно 0,8 мкл БЭ на 100 мл агарозы.

• Помещаем ванночку для заливки гелей на столик с винтовыми опорами. Используя уровень, приводим форму для геля в строго горизонтальное положение. Перпендикулярно форме устанавливаем гребенку. Между зубцами гребенки и дном ванночки должен оставаться зазор 0,5 – 1 мм, так чтобы дном формируемых лунок служил тонкий слой геля.

• Выливаем в приготовленную форму раствор агарозы и оставляем для полимеризации при комнатной температуре на 45 минут.

• По окончании полимеризации осторожно вынимаем гребенку.

Нанесение проб и электрофорез:

• В электрофоретическую камеру с буфером ТВЕ помещаем готовый гель. Буфер должен покрывать гель слоем не менее 1 – 2 мм.

• Смешиваем пробы с буфером нанесения: на каждые 10 мкл пробы – 2 мкл буфера. Вносим смесь в лунки геля под покрывающий его буфер.

• Подсоединяем электроды к источнику постоянного тока, при этом ближайший к лункам электрод должен быть заряжен отрицательно. Устанавливаем необходимое напряжение (примерно 5 В на каждый см длины геля). Проводим электрофорез до тех пор, пока лидирующий краситель – бромфеноловый синий - не подойдет к противоположному концу геля на 1,5 – 2 см.

• Помещаем гель на стекло трансиллюминатора и фотографируем фрагменты ДНК в проходящем УФ – свете. Фотографировать можно как цифровой камерой, так и обычным фотоаппаратом. Существуют также специальные системы для фотографирования и документирования гелей, которые сразу дают изображение геля в виде файла в форматах .TIF или .JPG. В нашей работе использовалась Гель-визуализирующая система (ДНК-Технология, Россия)