3 Цель и задачи работы

Целью дипломной работы являлась: оценка эффективности молекулярных маркеров генов устойчивости пшеницы к бурой ржавчины и молекулярный скрининг этих генов у новых российских сортов пшеницы.

Задачи исследований:

1. Изучение эффективности пяти молекулярных маркеров гена Lr24.

2. Изучение эффективности трех молекулярных маркеров гена Lr34.

3. Проведение молекулярного скрининга гена Lr34 у новых российских сортов пшеницы, рекомендованных для выращивания в РФ в 2010 году.

4 Экспериментальная часть

4.1 Материалы исследования

Для постановки ПЦР со специфичными праймерами использовали ДНК пробы контрольного набора линий — носителей 52 генов устойчивости к бурой ржавчине (Lr-линий), хранящихся в коллекции ДНК лаборатории микологии и фитопатологии (Таблица 1). Для идентификации гена Lr34 в исследования были включены 16 российских озимых сортов пшеницы, рекомендуемых к выращиванию в РФ с 2010 года, ДНК пробы которых были получены ранее (Таблица 4). Для изучения эффективности маркера гена Lr24 и его идентификации у сортов дополнительно в анализ включены 16 образцов пшеницы, из которых были получены ДНК-пробы (Таблица 4).

Таблица 4 — Сорта пшеницы, используемые для выделения ДНК

№	Название сорта	№	Название сорта
Российские озимые сорта пшеницы		Образцы пшеницы, используемы для изучения маркеров гена Lr24
1	АНТОНИВКА	1	Agent
2	БЕРЕЗИТ	2	Arapahoe
3	ГРОМ	3	Collin
4	ДОН 107	4	Siouxland
5	ДОНЭКО	5	TAM 106
6	КАМЫШАНКА 4	6	Colt

Продолжение таблицы 4

№	Название сорта	№	Название сорта
Российские озимые сорта пшеницы		Образцы пшеницы, используемы для изучения маркеров гена Lr24
7	КРАЛЯ	7	K51289 FOX
8	КСЕНИЯ	8	К92385Arapahoe
9	ЛЫТАНИВКА	9	К51787Оsage
10	НОВОСИБИРСКАЯ 40	10	Фаворит
11	РАПСОДИЯ	11	Воевода
12	САМУРАЙ	12	Белянка
13	СИЛА	13	TcLr24
14	СКАРБНИЦА	14	Agent
15	ТОРРИЛД	15	Agent
16	ЮМПА

4.2 Методы исследований

4.2.1 Выделение днк из пшеницы

Для выделения ДНК из растений пшеницы, семена растений сеяли в кюветы на слой ваты, обильно смоченный водой, кювету прикрывали стеклом для поддержания оптимальной влажности. Через 2 дня стекло снимали. Для выделения ДНК использовали 5-7-дневные проростки пшеницы.

Рисунок 2 — Выращивание пшеницы

Выделение микроколичеств тотальной ДНК злаков при помощи додецилсульфата натрия (SDS) [74].

Метод основан на том, что при 0С примеси белков и полисахаридов в экстрактах образуют комплексы с додецилсульфатом калия и выпадают в осадок. ДНК при этом остается в растворе.

Оборудование: общее лабораторное оборудование, водяная баня, центрифуга Эппендорф для микропробирок, автоматические пипетки различного объема.

Приготовление растворов:

1) Экстракционный буфер (200 мМ трис - HCl, рН 7,5; 250 мМ NaCl; 25 мМ ЭДTА, 0,5 % SDS) – объем 100 мл:

1 М трис - HCl, рН 7,5 20 мл;

5 М NaCl 5 мл;

0,5 М ЭДТА. 5 мл;

10 % SDS 5 мл

Н₂О до 100 мл.

2) 65%-ный этанол – объем 200 мл:

96 % этанол 135 мл

Н₂О до 200 мл

3) 5М раствор ацетата калия:

49,1 г СН₃СООК растворить в воде и довести объем до 100 мл.

Ход работы:

• Нарезаем листья кусочками примерно по 5 мм и помещаем 3 отрезка в пробирку типа Eppendorf. Раститаем предварительно охлажденным микропестиком. Планшет с пробирками держим на льду.

• Добавляем 400 мкл экстракционного буфера. Тщательно перемешиваем в течение 5 минут.

• Помещаем пробирки на водяную баню с температурой воды 65С. Инкубируем в течение 15 минут, периодически перемешивая.

• Добавляем 200 мкл 5М ацетата калия и осторожно перемешиваем, несколько раз инвертируя пробирку.

• Выдерживаем пробирки на льду в течение 10 минут. Центрифугируем в течение 20 минут при 14000 об/мин.

• Отбираем водную фазу (примерный объем 500 мкл) и переносим ее в чистые пробирки (каждую пробу отдельным наконечником).

• Добавляем равный объем изопропанола (500 мкл). Формируем осадок на льду в течение 20-30 минут. Осаждаем ДНК центрифугированием при 14000 об/мин в течение 10 минут.

• Сливаем надосадочную жидкость, промакиваем пробирки фильтровальной бумагой (следя, чтобы пробирки на бумаге касались только чистого места). Добавляем 1 мл охлажденного 65% этанола.

• Встряхивая пробирки, промываем осадок 5-10 минут в этаноле и вновь центрифугируем при 14000 об/мин в течение 20 минут.

• Удаляем спирт, подсушиваем на воздухе и растворяем в 100 мкл деионизированной воды при комнатной температуре (примерно в течение часа).

Выделенной ДНК достаточно для проведения 40-50 ПЦР.