1.2.2.6 Single Nucleotide Polymorphism (snp) маркеры

SNP — это однонуклеотидные позиции в геномной ДНК, для которых в некоторой популяции имеются различные варианты последовательностей (аллели), причём редкий аллель встречается с частотой не менее 1%. Полиморфизм единичных нуклеотидов является самым распространенным типом вариабельности последовательностей ДНК и наиболее перспективен для практического применения. Практический интерес к SNPs сильно возрос в ходе реализации проектов по определению полных нуклеотидных последовательностей ряда модельных организмов. В самом определении SNPs заложена ориентация на их использование в качестве генетических маркеров (ограничение по частоте встречаемости противопоставляет их редким мутациям). Никакой другой тип геномных различий не способен обеспечить такую плотность картирования. Помимо высокой плотности, SNPs имеют очень низкий уровень мутаций на поколение (~10^-8), что делает их удобными маркерами молекулярной эволюции. Множество способов детекции и обнаружения SNP основаны на различных модификациях ПЦР, что значительно упрощает их использование [59].

SNP маркер гена Lr1 был создан на основе STS маркера, имевшего низкую специфичность [6]. В своей работе авторы, используя широкую базу секвенированных последовательностей генома пшеницы, идентифицировали точечную мутацию, которая тесно сцеплена с геном Lr1, и на основе этого разработали SNP маркер Lr1_98F. Проведя эксперименты с использованием этого маркера на почти 100 линиях пшеницы, установлены 4 генотипа: T, C+T, C и “0”, причем встречаемость T аллеля была тесно связана с наличием гена Lr1.

1.2.3 Использование молекулярных маркеров для идентификации генов устойчивости пшеницы к бурой ржавчине Lr24 и Lr34

1.2.3.1 Идентификация гена Lr24

Ген устойчивости к бурой ржавчине Lr24 передан мягкой пшеницы от пырея. Данный ген обеспечивает высокую защиту от патогена во многих странах. Поскольку он сцеплен с геном устойчивости к стеблевой ржавчине Sr24, то кроме устойчивости к бурой ржавчине данная транслокация обеспечивает надежную защиту от этих двух вредоносных видов ржавчин.

Ген Lr24 получил широкое распространений в сортах мировой селекции, в частности в США, Европе, Австралии. В настоящее время его начали использовать и в России в ряде селекцентров. Для проведения МАС селекции и идентификации этого гена в гибридных комбинациях необходимо наличие надежного маркера, способствующего определять данный ген.

В литературе на настоящий момент описано 5 маркеров гена Lr24: J09 [60], Sr24≠12, Sr24≠50, Barc71 [61], SC-H5 [62].

SCAR маркер SC-H5 был разработан Dedryever и соавтрорами [62] и использовался в ряде лабораторий для идентификации гена Lr24. В литературе имеются противоречивые данные об эффекти данного маркера. Согласно Nocente и соавторов [63] данный маркер имел высокую эффективность при идентификации гена Lr24. При этом, по данным Chelkowski и соавторов [64] он показал абсолютную неэффективность при его оценке на изогенных линиях Тэтчер. Фрагмент амплификации кроме контрольной линии наблюдался у 30 других линий, которые несли гены отличные от Lr24.

STS-маркер J09 является одним из широко используемых при скрининге пшеницы. По данным Cheјkowski и соавторов [64] при проверке его эффективности на изогенных линиях характерный фрагмент амплификации размером 310 п.о. был выявлен у двух линий Lr24 и Lr25. Тырышкиным Л.Г и соавторами [65] показано, что маркер J09 гена Lr24 не всегда достоверно может определять наличие этого гена и в сортах, не смотря на то, что он широко используется в селекции. У 12 из 29 образцов, защищенных геном Lr24 по данным фитопатологического теста, с использованием праймеров J09 были синтезированы маркерные компоненты длиной 310 п.о. STS-маркер J09 был разработан на основе RFLP пробы ДНК у почти изогенных линий пшеницы, несущих ген Lr24 [66]. У 17 образцов маркерных компонентов не обнаружено. В эту группу входят сорта ТАМ 200, Century, Cimmaron, Skua и Torres, в которых, по литературным данным, имеется ген устойчивости Lr24 [67]. У образцов MN 81330, PF 84316, BR 16, BR 31, BR 34. ОС8826, OCEPAR 11 - Juriti, PYN/BOW наличие этого гена показано нами ранее с помощью гибридологического анализа [65]. Ген Lr24 передан в геном мягкой пшеницы от Agropyron elongatum по крайней мере дважды: путем естественной транслокации в межвидовом гибриде [68] и путем индукции гомеологического спаривания [69]. В первом случае был транслоцирован более длинный фрагмент хромосомы [70]. По данным Schachermayr и др. [71], маркер J09 локализован в транслокации первого типа. Можно предположить, что образцы, идентифицированные как имеющие ген Lr24, но характеризующиеся отсутствием специфического STS-маркера, являются производными линий с более короткой транслокацией.

Маркеры Sr24≠50 и Sr24≠12 были разработаны в Австралии Mago и соавтрами [61] в дополнение к двум вышеперечисленным маркерам и для более адекватной идентификации обоих пшенично-пырейных транслокаций у пшеницы. Данные STS маркеры созданы на основе AFLP маркеров. Три AFLP фрагмента связанные с присутствием гена устойчивости к стеблевой и бурой ржавчинам 9Sr24/Lr24 (≠12, 50, 59) были секвенированы и на основе этого были разработаны 2 специфических STS-маркера. Проверка эффективности этих двух маркеров показала неравную их достоверность в идентификации как короткой (3Ag/1BS), так и длинной транслокации (3Ag, 3DL, сорт Agent). Если маркер Sr24≠12 был тесно сцеплен с Lr24, то Sr24≠50 иногда показывал ошибочную идентификацию [61].

Микросателлитный маркер barc71 был разработан в этих же исследованиях. Поскольку два вышеперечисленных маркера были доминантными и не могли дифференцировать гетерозиготные фенотипы, то были подобраны несколько SSR-маркеров, которые были картированы предварительно на длинном плече хромосомы 3D. Для определения их сиквенсов была использована международная база данных [72]. Среди шести изученных микросателлитных маркеров только один barc71 позволил провести различия между устойчивыми и восприимчивыми линиями. Вarc71 наиболее отдаленный маркер картированный на длинном плече хромосомы 3D пшеницы, и все сорта несущие ген Lr24/Sr24 амплифицировали два фрагмента 103 и 85 п.о. Большинство восприимчивых Lr24/Sr24 линий показало фрагмент 107 п.о., а некоторые сорта не несущие эту транслокацию имели другой размер фрагментов. Среди протестированных линий маркер barc71 показал эффективность также не во всех генотипах.

Поскольку данные маркеры используются в ряде научно-исследовательских учреждения России, то необходимо более детальная их характеристика по эффективности для массового применения.