- •Эффективность пцр-маркеров генов устойчивости пшеницы к бурой ржавчине
- •5.3.3 Обсуждение результатов исследования маркеров
- •1.1.3 Симптомы болезни
- •1.2 Использование молекулярных маркеров для идентификации генов устойчивости пшеницы к бурой ржавчине
- •1.2.1 Гены устойчивости пшеницы к бурой ржавчине (Lr-гены)
- •1.2.2 Молекулярные маркеры Lr-генов
- •1.2.2.1 Restriction Fragment Length Polymorphism (rflp) и Randomly Amplified Polymorphic dna (rapd) – маркеры
- •1.2.2.2 Sequence Tagged Site (sts) маркеры
- •1.2.2.3 Sequence-Characterized Amplified Regions (scar) маркеры
- •1.2.2.4 Cleaved Amplified Polymorphic Sequences (caps) маркеры
- •1.2.2.5 Микросателлитные маркеры (ssr – маркеры)*
- •1.2.2.6 Single Nucleotide Polymorphism (snp) маркеры
- •1.2.3 Использование молекулярных маркеров для идентификации генов устойчивости пшеницы к бурой ржавчине Lr24 и Lr34
- •1.2.3.1 Идентификация гена Lr24
- •1.2.3.2 Идентификация гена Lr34
- •2 Патентный поиск
- •3 Цель и задачи работы
- •4 Экспериментальная часть
- •4.1 Материалы исследования
- •4.2 Методы исследований
- •4.2.1 Выделение днк из пшеницы
- •4.2.2 Электрофорез в горизонтальных агарозных гелях [75]
- •4.2.3 Проведение полимеразной цепной реакции [75]
- •5 Результаты и обсуждения
- •5.1 Определение концентрации днк в рабочем растворе
- •5.2 Изучение маркера гена Lr24
- •5.2.1 Оценка специфичности пяти днк-маркеров гена Lr24
- •5.2.2 Оценка специфичности пяти днк-маркеров гена Lr24 на сортах мягкой пшеницы
- •5.2.3 Обсуждение результатов исследования маркеров гена Lr24
- •5.3 Изучение маркеров гена Lr34
- •5.3.1 Оценка специфичности трех днк-маркеров гена Lr34
- •5.3.2 Идентификация гена Lr34 у сортов мягкой пшеницы
- •5.3.3 Обсуждение результатов исследования маркеров гена Lr34
- •6 Выводы
- •7 Список использованных источников
1.2.2.5 Микросателлитные маркеры (ssr – маркеры)*
Микросателлитные или SSR последовательности — это участки генома, состоящие из очень коротких (2-6 пар нуклеотидов) тандемно повторяющихся последовательностей. Встречаются и повторы, состоящие из одного нуклеотида, например, (Т)n. Количество единиц внутри повторяющегося участка сильно варьирует на уровне популяций, сортов и даже отдельных особей одного вида, поэтому вероятность обнаружения полиморфизма родительских форм весьма значительна. Для амплификации микросателлитных локусов последовательности праймеров выбирают не в самом тандемном повторе, а во фланкирующих его уникальных участках. Протяженность таких праймеров должна быть достаточно высока (20 – 25 п.н.), что снижает риск неспецифического связывания и обеспечивает высокую воспроизводимость результатов. Существует также методика так называемой якорной ПЦР (ancer-PCR). Выбор праймеров при якорной ПЦР производится таким образом, что они располагаются на границе уникального участка и микросателлитного повтора. Такие праймеры содержат несколько нуклеотидов из фланкирующего уникального участка и несколько повторяющихся нуклеотидов. Наличие небольшого уникального участка не дает праймеру возможности располагаться в любом месте микросателлитного повтора и обеспечивает точность его связывания.
Преимуществом данного типа маркеров является высокий уровень регистрируемого полиморфизма, хорошая воспроизводимость результатов и техническая простота экспериментов. Многие микросателлиты ассоциированы с конкретными генами или картированы на хромосомах, что облегчает подбор праймеров для картирования определенных областей генома [53].
Анализ состоит из 3 этапов:
Выделение ДНК из исследуемых образцов;
Амплификация ДНК при помощи пары микросателлитных праймеров;
Электрофоретическое разделение полученных фрагментов.
Последний этап выявляет главный недостаток SSR-маркеров: очень часто различия между аллелями составляют несколько нуклеотидов, поэтому для разделения фрагментов требуется применение трудоемких полиакриламидных гелей.
Из других недостатков стоит выделить неравномерность скорости мутирования разных микросателлитов, что создает определенные сложности для популяционно-генетического анализа. Имеются и технические проблемы, такие как артефакты при проведении ПЦР (за счет эффекта "проскальзывания"), сложности в разработке технологий для автоматического скрининга микросателлитных аллелей. Кроме того, несмотря на высокую плотность микросателлитных локусов в геноме, их бывает недостаточно для тонкого картирования отдельных областей геномов, создания маркеров для локусов количественных признаков (QTL) и решения многих других задач [53].
Микросателлитные маркеры предложены для идентификации генов Lr13, Lr34, Lr39, Lr46, Lr47, Lr50 (Таблица 2).
Как было описано выше, недостаток для широкого практического использования микросаттелитных маркеров – необходимость использования полиакриламидных гелей. При этом при использовании микросателлитного маркера GDM35 гена Lr39 характерные фрагменты амплификации четко визуиализируются в агарозном геле, что делает этот маркер более доступным в применении [58].