1.2.2.2 Sequence Tagged Site (sts) маркеры

Первоначально STS-маркеры создавались на основе различных технологий, но впоследствии был осуществлен перевод на основу ПЦР для более удобного применения. Основными требованиями к STS-маркерам – знание их нуклеотидной последовательности и уникальность в геноме. STS-анализ крайне прост и состоит из следующих этапов:

1. Выделение ДНК из исследуемых образцов;

2. Амплификация ДНК при помощи пары специфичных праймеров;

3. Электрофоретическое разделение полученных фрагментов.

Первый STS-маркер был создан Schachermayr и соавторами [9] для идентификации гена Lr9, переданного мягкой пшенице от Aegilops umbellulata. Молекулярный маркер гена Lr9 был разработан на основе RAPD-фрагмента почти изогенных линий, несущих ген Lr9, cцеплен с ним и находится на расстоянии около 8сМ от гена. Высокая специфичность этого маркера при идентификации гена Lr9 у широкого набора сортов показана многими исследователями [9, 43, 51, 52]. С помощью этого маркера у образцов пшеницы имеющих ген Lr9, обнаруживается фрагмент амплификации размером 1100 п.о.

Другими примерами STS-маркеров, полученных на основе RFLP и RAPD-технологий являются маркеры следующих генов: Lr1, Lr10, Lr19, Lr20, Lr21, Lr24, Lr28 и Lr35 (Таблица 2). Рядом исследователей отмечена низкая специфичность маркеров генов Lr1 и Lr28 [6, 43, 52]. Для надежности идентификации на основе маркера гена Lr1 впоследствии был разработан SNP-маркер [6].

1.2.2.3 Sequence-Characterized Amplified Regions (scar) маркеры

SCAR маркеры разрабатываются на основе полиморфных фрагментов, обнаруживаемых при RAPD-анализе. Для получения локус-специфичных маркеров интересующий исследователя фрагмент экстрагируют из геля, клонируют и секвенируют. На основе полученной последовательности подбирают праймеры, которые амплифицируют единичный фрагмент с высокой степенью воспроизводимости. Полученные таким способом вторичные маркеры и названы SCAR-маркерами [53]. Многие из них кодоминантны и могут быть использованы как уникальные маркеры в различных областях исследований. Полиморфизм SCAR-маркеров может быть увеличен путем рестрикционного анализа ПЦР-продукта. SCAR-анализ состоит из тех же самых этапов что и STS и удобен для практического использования.

Примерами SCAR маркеров для идентификации Lr-генов являются маркеры IB-267 и IAQ95 гена Lr26 [29]; Lr25F20 и Lr25R19 — гена Lr25, две пары маркеров: Lr29F18, Lr29R18 и Lr29F24, Lr29R24 — гена Lr29 [54], SCS421F и SCS421R — гена Lr28 [33], Sr39F и Sr39R — гена Lr35 [55].

1.2.2.4 Cleaved Amplified Polymorphic Sequences (caps) маркеры

CAPS маркеры основаны на сочетании методов амплификации и рестрикции. В том случае, если при использовании STS- или SCAR- маркеров размер амплифицированных фрагментов у родительских форм оказался одинаков, существует вероятность обнаружить полиморфизм путем обработки этих фрагментов рестриктазами. Поэтому CAPS анализ имеет большее количество этапов, по сравнению с STS и SCAR анализами и включает в себя:

1. Выделение ДНК из исследуемых образцов;

2. Амплификация ДНК при помощи пары специфичных праймеров;

3. Расщепление образующихся продуктов ПЦР одной или несколькими рестриктазами;

4. Электрофоретическое разделение полученных фрагментов.

Однако чаще всего создание CAPS-маркеров проводят на основе уже клонированных и секвенированных участков ДНК с известной хромосомной локализацией и сайты для различных рестриктаз определяют путем анализа уже известной последовательности ДНК при помощи специальных программ (например, Primer3).

Примерами CAPS маркеров для бурой ржавчины являются маркеры генов Lr37, Lr47, Lr51 (Таблица 2).

По данным Robert O, Abelard C, Dedryver F. [40] CAPS-маркер гена Lr37 имеет некоторые преимущества в сравнении с ПЦР-специфичным маркером: он кодоминантен, и для анализа может использоваться ДНК более низкого качества; при одном недостатке: требуется применение рестриктазы [42].

CAPS-маркер гена Lr47 идентифицирует соответствующую аллель хромосомы 7A Triticum aestivum в отличие от доминантного PCR-маркера маркирующего хромосому 7S дикого вида Triticum speltoides. Ген Lr47 был перенесен на хромосому 7A Triticum aestivum с хромосомы 7S вида пшеницы Triticum speltoides. Первоначально RFLP локус Xabc465 был использован для идентификации сегмента несущего Lr47, затем этот маркер был конвертирован в доминантный PCR-маркер. Для идентификации наличия соответствующей аллели хромосомы 7A был создан CAPS-маркер. Используя оба маркера возможна идентификация как гомо- так и гетерозигот [56].

Для идентификации гена Lr51 Helguera и соавторы разработали CAPS-маркер хромосомного сегмента AGA7 у T. speltoides, несущего этот ген [50]. Праймеры S30-13L and AGA7-759R позволяют амплифицировать аллель AGA7 в S и B геномах, и различают её в A и D геномах. Поскольку сегмент AGA7 не рекомбинирует с пшеничными хромосомами, то достаточно одного этого маркера в селекционных работах с указанным хромосомным сегментом [57].