1.2.2 Молекулярные маркеры Lr-генов

1.2.2.1 Restriction Fragment Length Polymorphism (rflp) и Randomly Amplified Polymorphic dna (rapd) – маркеры

До недавнего времени традиционными методами идентификации генов устойчивости являлись гибридологический анализ и фитопатологический тест. В начале 90-х годов прошлого столетия данные методы были дополнены молекулярными. Для идентификации ряда генов устойчивости и их картирования были использованы RFLP и RAPD – маркеры.

RFLP (ПДРФ) – используется как метод молекулярного анализа геномов — для идентификации и клонирования генов, а также для построения генетических карт. Суть метода заключается в том, что ДНК обрабатывается ферментами рестрикции и затем гибридизуется методом блот-гибридизации по Саузерну определенными молекулярными маркерами, меченными радиоактивной или нерадиоактивной меткой. Основные преимущества RFLP-анализа заключаются в его универсальности и высокой воспроизводимости, а при использовании в селекционном процессе - возможностиь определенияить положенияе генов на хромосоме. Для анализа необходимы значительные количества ДНК и требуется ее тщательная очистка. Значительных расходов требует поддержание большой библиотеки RFLP-клонов, приобретение реактивов и материалов, а также обеспечение безопасности при работе с радиоактивными материалами, что ограничивает использование этот метода массово. RFLP - маркеры разработаны для идентификации генов Lr3, Lr9, Lr13, Lr19, Lr20, Lr23, Lr24, Lr27+31, Lr32 и Lr34 (Таблица 2).

В сравнении с RFLP-анализом методы, основанные на PCR-технологии, требуют выделения значительно меньших количеств ДНК, при этом не требуетсянужно поддержание библиотеки клонов для гибридизационных зондов, саузерн-блоттинге и работе с радиоактивными изотопами. В зависимости от природы праймеров и способа идентификации продуктов амплификации различают несколько методов PCR-анализа. Первым появился метод случайно выбранных последовательностей ДНК (RAPD), в котором используют стандартные наборы праймеров (чаще всего праймеры состоят из десяти нуклеотидов), продукты амплификации разделяют в агарозном геле. Малый размер нуклеотидной последовательности праймера увеличивает вероятность нахождения комплементарного ей участка в обеих нитях ДНК, поэтому один и тот же праймер используется и в качестве прямого, и в качестве обратного праймера. RAPD-маркеры не связаны с определенными последовательностями генома, поэтому такой анализ RAPD анализ не требует предварительной информации о структуре изучаемых последовательностей.

Для удобства в практическом использовании большинство RFLP и RAPD маркеров, сцепленных с генами устойчивости к бурой ржавчине, были конвертированы в специфичные STS, CAPS, SCAR и другие типы маркеров (Таблица 2) [4].

Таблица 2 — Маркеры Lr-генов

Lr-ген	Источник гена	Маркеры	Локализация в геноме	Литературный источник
Lr1	Triticum aestivum	RFLP, STS	5DL	[5]
		SNP		[6]
Lr3	T. aestivum	RFLP	6BL	[7]
		ISSR		[8]
Lr9	Aegilops umbellulata	RAPD, STS	6BL	[9]
		RAPD-SCAR		[10]
		RFLP		[11]
Lr10	T. aestivum	RFLP, STS	1 AS	[12]
Lr13	T. aestivum	RFLP	2 BS	[13]
		SSR
Lr16	T. aestivum	SSR	2 BS	[14]
Lr18	T. timopheevii	N-band	5BL	[15]
Lr19	Agropyron elongatum	RFLP	7DL	[11]
		Isozyme		[16]
		AFLP, STS		[17]
		SCAR		[18]

Продолжение таблицы 2

Lr-ген	Источник гена	Маркеры	Локализация в геноме	Литературный источник
Lr20	T. aestivum	RFLP	5 AL	[7]
		RAPD, STS		[19]
Lr21	Ae. tauschii	RFLP, PCR-based marker	1DL	[20]
		STS		[21]
Lr23	T. turgidum	RFLP	2BS	[22]
Lr24	A. elongatum	RFLP	3DL	[11]
		RAPD, STS		[23]
		RAPD, SCAR		[24]
Lr25	Secale cereale	RAPD, SCAR	4BL	[25, 26]
Lr26	Secale cereale	RFLP, RGA, AFLP, SCAR	1BL/1RS trans.	[27, 28, 29]
		STS		[30]
			1B/1R trans.	[31]
Lr27	T. aestivum	RFLP	3BS	[22]
Lr28	Ae. speltoides	RAPD, STS	4 AL	[32]
		RAPD, TPSCAR		[33]

Продолжение таблицы 2

Lr-ген	Источник гена	Маркеры	Локализация в геноме	Литературный источник
Lr29	Ag. elongatum	RAPD, SCAR	7DS	[25] [34]
Lr31		RFLP	4BL	[22]
Lr32	Ae. tauschii	RFLP	3DS	[11]
		RAPD		[35]
Lr34	T. aestivum	RFLP	7DS	[22]
		RFLP, SSR		[36]
		SSR		[37]
Lr35	A. speltoides.	RFLP, STS	2B	[38, 39]
Lr37	A. ventricosa	RAPD, SCAR	2AS	[40]
		PCR marker specific for the N genome; CAPS		[41, 42]
		STS, SCAR, Pst1AFLP, SCAR		[43, 44]
Lr39	Ae. tauschii	SSR	2DS	[45]

Продолжение таблицы 2

Lr-ген	Источник гена	Маркеры	Локализация в геноме	Литературный источник
Lr46	T. aestivum	AFLP	1BL	[46]
		SSR		[36]
Lr47	A. speltoides.	CAPS	7AS	[47]
		RFLP, PCR-specific primers for the T. speltoides S genome allele of Xabc465 Alternative codominant PCR marker		[48]
Lr50	T. timopheevii ssp. armeniacum	SSR	2BL	[49]
Lr51	A. speltoides.	CAPS	1BL	[50]