5 Результаты и обсуждения
Изучение специфичности ДНК-маркеров Lr-генов и идентификация их у сортов пшеницы
Пшеничный геном — один из крупнейших среди выращиваемых культур, гаплоидный набор которого содержит 17 миллиардов пар оснований. Он сложен по своей структуре и включает в себя три генома A, B и D с семью гомологичными хромосомами. Разработка ПЦР-специфичных маркеров для мягкой пшеницы — более сложная задача, чем в случае диплоидных видов, потому что ПЦР может привести к амплификации аналогичного фрагмента из разных геномов [47]. По этой причине некоторые описанные в литературе STS-маркеры могут давать ложно-положительные результаты относительно наличия гена устойчивости в различных линиях и сортах различного генетического происхождения [4, 76].
Не смотря на это, в настоящее время во всех развитых странах использованию молекулярных маркеров для идентификации генов устойчивости к фитопатогенам отдается значительный приоритет. Молекулярный скрининг генов устойчивости к бурой ржавчине пшеницы широко используется в селекционных учреждениях Северной Америки (США, Канады) и ряде Европейских стран (Германии, Франции, Англии, Чехии, Польши и т.д.). В данных исследованиях особую значимость приобретает высокая специфичность маркера – т. е. возможность картирования определенного гена. При этом в литературе имеется ограниченная информация относительно эффективности использования для многих маркеров. Основным критерием достоверности большинства из них является маркирование определенного гена у положительных контролей, т.е. образцов – носителей этих генов, которые были идентифицированы с помощью фитопатологических и генетических методов при этом большинство из них не были протестированы на полном наборе контрольных линий. Значимость этого параметра была показана Chelkowski и соавторами для 9 маркеров генов Lr1, Lr9, Lr10, Lr19, Lr24, Lr28, Lr37 и Lr47 [76]. С использованием ограниченного набора Lr-линий они выявили высокую специфичность для изучаемых маркеров генов Lr9, Lr19 и Lr47. Один из двух используемых маркеров гена Lr24 показал аналогичный фрагмент на линии с геном Lr25, а маркер гена Lr10 на линии с геном Lr47. Второй маркер гена Lr24, как и маркеры Lr1 и Lr28 имели характерные амплификационные фрагменты у более 50% других изучаемых линий, что показывает их полную ограниченность для практического использования.
В настоящее время создано более 40 различных маркеров для более 30 Lr-генов и в литературе имеются достаточно противоречивые сведения об их эффективности. В связи с этим с использованием полного набора контрольных линий несущих 52 Lr-гена нами была проведена оценка эффективности 5 маркеров гена Lr24 и трех маркеров гена L34 и проведен скрининг этих генов у новых российских сортов пшеницы, рекомендуемых к выращиванию на территории РФ в 2010 году.
5.1 Определение концентрации днк в рабочем растворе
Выделение ДНК из листьев пшеницы проводили по методике, предложенной Edwards и др. в модификации Дорохова и Клоке [68], которая была предложена авторами для выделения ДНК из различных видов рода Allium, кукурузы, винограда и сорго.
Преимуществами данного метода являются быстрота, простота детектирования и необходимость крайне малого количества ДНК для анализа (5-25 нг).
Для определения концентрации ДНК использовали метод электрофореза в 0,8% геле и концентрацию ДНК определяли по интенсивности свечения фрагментов проб со свечением полос маркера, концентрация каждой из которых известна и контрольными образцам с известной концентрацией, измеренной с помощью спектрофотометра. Для анализа концентрации использовали компьютерную программу «Gel-Analyser».
Концентрация ДНК в пробах представлена на рисунке 3 и в таблице 7.
М – М100bp (Fermentas), Lr24 – сорта, проверяемые на наличие гена Lr24, Lr34 – сорта, проверяемые на наличие гена Lr34.
Рисунок 3 — Определение концентрации ДНК в рабочем растворе методом электрофореза
Таблица 7 — Концентрации ДНК у изучаемых проб согласно компьютерной программе «Gel-Analyser»
Ген, определяемый в пробе |
№ |
Номер пробы |
Название сорта |
Концентрация ДНК |
Lr24 |
1 |
1 |
Agent |
65 |
2 |
2 |
Arapahoe |
54 |
|
3 |
3 |
Collin |
51 |
Продолжение таблицы 7
Ген, определяемый в пробе |
№ |
Номер пробы |
Название сорта |
Концентрация ДНК |
Lr24 |
4 |
4 |
Siouxland |
58 |
5 |
5 |
TAM 106 |
52 |
|
6 |
6 |
Colt |
46 |
|
7 |
7 |
K51289 FOX |
43 |
|
8 |
8 |
К92385 Arapahoe |
72 |
|
9 |
9 |
К51787 Оsage |
47 |
|
10 |
10 |
Фаворит |
30 |
|
11 |
11 |
Воевода |
72 |
|
12 |
12 |
Белянка |
48 |
|
13 |
13 |
TcLr24 |
39 |
|
14 |
14 |
Agent |
60 |
|
15 |
15 |
Agent |
36 |
|
Lr34 |
16 |
1 |
АНТОНИВКА |
66 |
17 |
2 |
БЕРЕЗИТ |
54 |
|
18 |
3 |
ГРОМ |
53 |
|
19 |
4 |
ДОН 107 |
40 |
|
20 |
5 |
ДОНЭКО |
50 |
|
21 |
6 |
КАМЫШАНКА 4 |
79 |
|
22 |
7 |
КРАЛЯ |
48 |
|
23 |
8 |
КСЕНИЯ |
39 |
|
24 |
9 |
ЛЫТАНИВКА |
70 |
|
25 |
10 |
НОВОСИБИРСКАЯ 40 |
36 |
|
26 |
11 |
РАПСОДИЯ |
45 |
Продолжение таблицы 7
Ген, определяемый в пробе |
№ |
Номер пробы |
Название сорта |
Концентрация ДНК |
Lr34 |
27 |
12 |
САМУРАЙ |
55 |
28 |
13 |
СИЛА |
59 |
|
29 |
14 |
СКАРБНИЦА |
44 |
|
30 |
15 |
ТОРРИЛД |
49 |
|
31 |
16 |
ЮМПА |
48 |
Проведенный анализ показал, что в пробах № 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 29, 30, 31 концентрация ДНК соответствует рабочему раствору, используемому для постановки реакции, а все остальные пробы требуют соответствующего разведения до концентрации ≈50 ng.