4.2.3 Проведение полимеразной цепной реакции [75]

1) Постановка ПЦР

Полимеразная цепная реакция проводится в специальных приборах – амплификаторах или термоциклерах. Амплификатор снабжен термостатируемой крышкой, которая препятствует испарению проб при нагревании до высоких температур.

Для проведения ПЦР используют пробирки (чаще всего объемом 200 мкл) или планшеты. Пробирки должны иметь тонкие стенки, что обеспечивает хороший контакт с лунками амплификатора. Кроме того, они должны иметь хорошо закрывающиеся крышки, в противном случае содержимое пробирки может испариться. Планшеты для ПЦР заклеиваются специальными термостойкими пленками.

Реакционная смесь для проведения ПЦР должна содержать ДНК, реакционный буфер, смесь дезоксинуклеотидов (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, их смесь обозначают dNTP’s), прямой и обратный праймеры и фермент Taq-полимеразу. Проведение ПЦР требует очень небольшого количества ДНК: от 50 до 200 нг на реакцию.

Реакционный буфер обычно содержит буфер трис-НСl, KCl, MgCl₂, детергент тритон X-100, но может также содержать и некоторые другие компоненты, например, желатин. Состав буфера определяется фирмой-производителем полимеразы. У многих фирм ПЦР-буферы не содержат MgCl_2, и его приходится отдельно добавлять в реакционную среду. При работе же с буферами других фирм этого не требуется. Некоторые фирмы поставляют фермент одновременно с двумя реакционными буферами: содержащим и не содержащим MgCl₂.

Лучше использовать фермент и dNTP’s от одного производителя, потому что в некоторых случаях Taq-полимераза одного производителя не может работать с нуклеотидами другого.

ПЦР проводится в очень маленьких реакционных объемах: от 10 до 100 мкл. Наиболее часто используется объем 20 мкл.

Все компоненты реакционной смеси, кроме ДНК, предварительно смешиваются в отдельной пробирке (приготовление так называемого премикса) и затем распределяются по пробиркам или лункам планшета.

ПЦР – это очень чувствительный метод. Для успешной амплификации достаточно самых небольших количеств ДНК. При постоянной работе с одними и теми же праймерами происходит накопление в воздухе лаборатории ПЦР-продуктов, которые могут попасть в пробы и дать положительную реакцию. Поэтому смешивание растворов важно проводить или в особой комнате, или в специальной камере. Кроме того, нужно использовать наконечники с бумажными фильтрами для предотвращения заноса ДНК из пипеток (лучше использовать отдельные пипетки). Для контроля используют также нулевые пробы, содержащие все компоненты реакционной смеси, кроме ДНК.

Стандартная ПЦР включает в себя следующие этапы:

Предварительная денатурация ДНК:

прогревание пробы при 93 – 95C в течение 3–5 минут.

Циклическая программа:

денатурация 93 – 95C в течение 30 сек. – 1 мин.

отжиг Tm в течение 1 – 2 мин.

элонгация (синтез второй нити) 72C в течение 1 – 2 мин.

Количество циклов может варьироваться от 29 до 40

Заключительный этап:

72C в течение 5 – 10 мин.

Оборудование: амплификатор, автоматические пипетки на 10, 100, 1000 мкл, камера для предотвращения контаминации (желательно).

Ход работы:

• Определяем конечный объем реакционной смеси.

• Рассчитываем необходимое количество компонентов реакционной смеси. На каждые 10 – 15 пробирок необходимо добавлять одну лишнюю. Пример составления премикса для конечного объема 20 мкл представлен в таблице 5.

Таблица 5 — Состав реакционной смеси

Компонент смеси	На каждую пробу, мкл
Буфер (10х MgCl2 free)	2
dNTP’s (2,5 мМ)	1,6
MgCl2 (50 mM)	1,1
Прямой праймер (10 пкМ/мкл)	0,5
Обратный праймер (10 пкМ/мкл)	0,5
Tag-полимираза (5 ед/мкл)	0,2
Вода	12,1
Премикс	18
ДНК	2

• Тщательно перемешиваем премикс, осаждаем капли центрифугированием. Распределяем по пробиркам – по 18 мкл в каждую пробирку.

• Добавляем в каждую пробирку по 2 мкл раствора ДНК (50 нг/мкл). Конечный объем составляет 20 мкл.

• Перемешиваем, осаждаем капли центрифугированием. Плотно закрываем пробирки, подписываем их, помещаем в амплификатор, тщательно закрываем крышку и запускаем реакцию.

• После окончания реакции помещаем пробирки в морозильник, либо сразу подвергаем электрофорезу (предварительно добавив буфер нанесения)

2) Оптимизация условий реакции

Праймеры для работ по идентификации генов чаще всего подбирают по литературным источникам. Там же должны быть указаны условия реакции и, в частности, температура отжига (Tm) для каждой пары праймеров.

Если такая температура не приводится, ее можно рассчитать по формуле:

(Число A + T пар  2 + число G + C пар  4) – 5

Например, для праймера CCTTAATCCAGGGAACTCTCAG

температура равна:

число A + T пар 11  2 = 22

число G + C пар 11  4 = 44

сумма 66 – 5 = 61С.

При использовании 2-х праймеров с разными температурами нужно использовать меньшую. Однако температуры отжига праймеров не должны сильно отличаться друг от друга.

При работе с известными праймерами начинаем с тех условий реакции, которые указаны в литературных источниках. Если результат отличается от описанного в литературе и не является удовлетворительным, то можно попытаться варьировать состав реакционной смеси и условия протекания реакции.

При отсутствии продуктов реакции можно попробовать понизить температуру отжига, а также увеличить время отжига и/или время синтеза второй нити. При наличии большого количества неспецифичных компонентов, нужно, наоборот, повысить температуру отжига и варьировать концентрацию MgCl_2. Уменьшить неспецифическое связывание праймеров помогают программы с градиентом температуры: температура отжига в первом цикле задается на 2 – 3 градуса выше, и в течение 5–10 циклов опускается до необходимой Tm.

Маркеры, которые были использованы в данной работе, последовательности нуклеотидов в праймерах и программы амплификации, соответствующие данным маркерам перечислены в таблице 6.

Таблица 6 — Специфические праймеры и условия проведения ПЦР

Определяемый ген	Названия праймеров	Последовательность нуклеотидов в праймерах	Размеры ампликона, п.о.	Программа для амплификатора	Ссылка
Lr24	J09/1 J09/2	TCTAGTCTGTACATGGGGGC TGGCACATGAACTCCATACG	310	94C – 3 мин.; 40 циклов (92C – 30 сек., 60C – 30 сек., 72C – 1 мин.); 72C – 5 мин.	[60]
Lr24	Sr24≠12/1 Sr24≠12/2	CACCCGTGACATGCTCGTA AACAGGAAATGAGCAACGATGT	500	94C – 3 мин.; -1C/цикл 7 циклов (94C – 30 сек., 65C – 30 сек., 72C – 40 сек.); 30 циклов (94C – 30 сек., 58C – 30 сек., 72C – 40 сек.); 72C – 5 мин.	[61]
Lr24	Sr24≠50/1 Sr24≠50/2	CCCAGCATCGGTGAAAGAA ATGCGGAGCCTTCACATTTT	200	94C – 3 мин.; 30 циклов (94C – 30 сек., 57C – 30 сек., 72C – 40 сек.); 72C – 5 мин.	[61]

Продолжение таблицы 6

Определяемый ген	Названия праймеров	Последовательность нуклеотидов в праймерах	Размеры ампликона, п.о.	Программа для амплификатора	Ссылка
Lr24	Barc71/1 Barc71/2	GCGCTTGTTCCTCACCTGCTCATA GCGTATATTCTCTCGTCTTCTTGTTGGTT	107 85	94C – 3 мин.; 30 циклов (94C – 30 сек., 63C – 30 сек., 72C – 40 сек.); 72C – 5 мин.	[61]
Lr24	SC-H5/1 SC-H5/2	AGTCGTCCCCGAAGACCCGCTGGA TCGTCCCCTGATGCCATGTAATGT	700	94C – 3 мин.; 38 циклов (92C – 1 мин., 68C – 2 мин., 72C – 2 мин.); 72C – 5 мин.	[62]
Lr34	Xgwm130/1 Xgwm130/2	AGCTCTGCTTCACGAGGAAG CTCCTCTTTATATCGCGTCCC	130	94C – 5 мин.; 45 циклов (94C – 20 сек., 58C – 20 сек., 72C – 30 сек.); 72C – 7 мин.	[73]

Продолжение таблицы 6

Определяемый ген	Названия праймеров	Последовательность нуклеотидов в праймерах	Размеры ампликона, п.о.	Программа для амплификатора	Ссылка
Lr34	Xbarc352/1 Xbarc352/2	CCCTTTCTCGCTCGCCTATCCC CTGTTTCGCCCAATCTCGGTGTG	248	94C – 4 мин.; 38 циклов (94C – 30 сек., 60C – 30 сек., 72C – 1 мин.); 72C – 5 мин.	[73]
Lr34	csLV34/1 csLV34/2	GTTGGTTAAGACTGGTGATGG TGCTTGCTATTGCTGAATAGT	150	94C – 5 мин.; 40 циклов (94C – 45 сек., 55C – 30 сек., 72C – 1 мин.); 72C – 7 мин.	[73]

После амплификации в каждую пробу добавляем по 3 мкл буфера нанесения и подвергаем гель-электрофорезу с концентрацией геля 1,5% – 3%, в зависимости от используемого маркера. Наличие характерных фрагментов определенного размера указывает на присутствие идентифицируемого гена у образцов. Маркеры молекулярного веса — 50, 100 bp и 1 kb DNA (Fermentas, Литва) используются для оценки размеров фрагментов. Электрофорез проводим в течение 1 – 3 часов при 100 В. После гель фотографируем в УФ-свете с использованием гель-визуализирующей системы (ДНК-технология, Россия).