Эффективность пцр-маркеров генов устойчивости пшеницы к бурой ржавчине

Реферат

Дипломная работа «Эффективность ПЦР-маркеров генов устойчивости пшеницы к бурой ржавчине» представлена на 117 страницах, содержит 16 таблиц, 21 рисунок, 2 приложения, Список библиографических источников включает 87 наименований.

В данной дипломной работе было проведено исследование по оценки эффективности ПЦР-маркеров генов устойчивости пшеницы к бурой ржавчине Lr24 и Lr34 для широкомасштабного применения, а также проверка новых сортов пшеницы, рекомендованных к выращиванию в РФ, на наличие этих генов.

СОДЕРЖАНИЕ

Введение стр. 6

1 Аналитический обзор стр. 8

1.1 Характеристика возбудителя бурой ржавчины пшеницы стр. 8

1.1.1 Систематическое положение стр. 8

1.1.2 Биологические особенности стр. 8

1.1.3 Симптомы болезни стр. 10

1.2 Использование молекулярных маркеров для

идентификации генов устойчивости пшеницы

к бурой ржавчине стр. 12

1.2.1 Гены устойчивости пшеницы к бурой

ржавчине (Lr-гены) стр. 12

1.2.2 Молекулярные маркеры Lr-генов стр. 18

1.2.2.1 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)

и Randomly Amplified Polymorphic DNA

(RAPD) – маркеры стр. 18

1.2.2.2 Sequence Tagged Site (STS) маркеры стр. 24

1.2.2.3 Sequence-Characterized Amplified Regions (SCAR)

маркеры стр. 25

1.2.2.4 Cleaved Amplified Polymorphic Sequences (CAPS)

маркеры стр. 26

1.2.2.5 Микросателлитные маркеры (SSR – маркеры) стр. 28

1.2.2.6 Single Nucleotide Polymorphism (SNP) маркеры стр. 30

1.2.3 Использование молекулярных маркеров для

идентификации генов устойчивости пшеницы к бурой

ржавчине Lr24 и Lr34 стр. 31

1.2.3.1 Идентификация гена Lr24 стр. 31

1.2.3.2 Идентификация гена Lr34 стр. 34

2 Патентный поиск стр. 36

3 Цель и задачи работы стр. 38

4 Экспериментальная часть стр. 39

4.1 Материалы исследования стр. 39

4.2 Методы исследований стр. 41

4.2.1 Выделение ДНК из пшеницы стр. 41

4.2.2 Электрофорез в горизонтальных агарозных гелях стр. 44

4.2.3 Проведение полимеразной цепной реакции стр. 48

5 Результаты и обсуждения стр. 57

5.1 Определение концентрации ДНК в рабочем растворе стр. 59

5.2 Изучение маркера гена Lr24 стр. 63

5.2.1 Оценка специфичности пяти ДНК-маркеров гена Lr24 стр. 63

5.2.2 Оценка специфичности пяти ДНК-маркеров гена Lr24

на сортах мягкой пшеницы стр. 69

5.2.3 Обсуждение результатов исследования маркеров

гена Lr24 стр. 72

5.3 Изучение маркеров гена Lr34 стр. 74

5.3.1 Оценка специфичности трех ДНК-маркеров гена Lr34 стр. 74

5.3.2 Идентификация гена Lr34 у сортов мягкой пшеницы стр. 77

5.3.3 Обсуждение результатов исследования маркеров

гена Lr34 стр. 79

6 Выводы стр. 81

7 Список использованных источников стр. 82

Приложение А стр. 91

Приложение Б стр. 104

ВВЕДЕНИЕ

Пшеница является важнейшей продовольственной и кормовой культурой. Она занимает лидирующее место среди возделываемых во всём мире культур по посевным площадям. В Российской Федерации посевы озимой и яровой пшеницы ежегодно составляют 23-25 млн. га. Её широкое распространение объясняется высокой питательностью и возможностью разностороннего использования и переработки.

Увеличение производства зерна возможно, главным образом, за счёт роста урожайности и снижения потерь, в том числе и от заболеваний. Применение химических средств защиты растений связано не только с экономическими затратами, но, самое главное, с отрицательным воздействием на окружающую среду. Во всем мире устойчивый сорт является важнейшим элементом в системе защиты растений от болезней и вредителей. Одной из наиболее вредоносных и экономически значимых болезней пшеницы является бурая (листовая) ржавчина. Возбудитель бурой ржавчины пшеницы Puccinia triticina Erikss.(= Puccnia recondita Roberge ex Desmazieres f.sp. tritici) адаптирован к разнообразным климатическим условиям, вследствие чего это заболевание встречается ежегодно во всех регионах культивирования пшеницы в мире. По данным Всероссийского института фитопатологии за десятилетний период ее эпифитотии в Центральном и Поволжских регионах наблюдались пять раз, и потери урожая составляли 20-30 %, в Северо-Кавказском, Центрально-Черноземном и Волго-Вятском – три раза и потери урожая достигали 30-35%, 15-25 % и 15-20 %, соответственно.

В России селекция пшеницы на устойчивость к листовой ржавчине проводится более 50 лет. При этом бурая ржавчина до настоящего времени остается одной из вредоносных болезней, несмотря на значительный прогресс в изучении природы устойчивости к ней, структуры и изменчивости популяций патогена, а также достижений в практической селекции на устойчивость. Для создания прочного барьера защиты пшеницы от ржавчины необходим анализ генотипов возделываемых сортов и используемых доноров устойчивости на предмет общности или различий их генов.

По состоянию на 2009 год во всем мире идентифицировано 60 генов устойчивости к бурой ржавчине (Lr-гены) [1], многие из них имеют широкое распространение в районированных сортах и, несмотря на их неэффективность, оказывают определенное влияние на формирование и существование популяций патогена. До недавнего времени основными методами определения генов устойчивости были гибридологический анализ и использование тест-клонов маркированных вирулентностью к определенному гену (фитопатологический тест). Однако эти методы имеют ряд ограничений в использовании из-за длительности во времени (в случае гибридологического анализа) или отсутствия клонов с редкой вирулентностью или авирулентностью (фитопатологический тест). С середины 1990-х годов с началом развития молекулярно-генетических исследований в данном направлении были созданы маркеры для идентификации ряда генов устойчивости к бурой ржавчине пшеницы. Для более эффективной идентификации и практического применения на базе RAPD, AFLP и RFLP полиморфных фрагментов ДНК были разработаны STS, CAPS, SCAR, SSR, SNP маркеры. Однако, для широкого применения этих маркеров при идентификации Lr-генов необходима детальная проверка их специфичности на широком наборе сортов.

1 Аналитический обзор

1.1 Характеристика возбудителя бурой ржавчины пшеницы

1.1.1 Систематическое положение

Возбудитель бурой, листовой ржавчины пшеницы – гриб P. triticina Erikss (Puccinia recondita Rob.ex.Desm. f. sp. tritici) относится к классу Basidiomycetes, порядку Uredinales, семейству Pucciniaceae.

1.1.2 Биологические особенности

P. triticina имеет полный цикл развития. В процессе развития гриба последовательно образуется 5 форм спороношения: 0 (спермогонии), I (эции), II (урединии), III (телии), IV (споридии или базидии с базидиоспорами). Питающие растения, на которых образуются все формы спороношения или только урединии и телии, называются основными, а несущие спермогонии и эции – промежуточными.

Возбудитель бурой ржавчины пшеницы относится к разнохозяйным грибам: пикниды и эции формируются на промежуточных хозяевах. В Европейской части РФ, на Кавказе, в Средней Азии, в Сибири, на Дальнем Востоке промежуточниками являются василистник (Thalictrum flavum L.), в Сибири — лещица дымянковидная (Leptopyrum fumarioides). Заражение их осуществляется базидиоспорами, которые в естественных условиях образуются весной, когда телиоспоры ржавчины приобретают способность к прорастанию после периода покоя. Телиоспоры дают начало 4-х клеточной базидии с 4-мя стеригмами, на каждой из которых образуется по 1-й базидиоспоре. Базидиоспоры у P. recondita одноклеточные и гаплоидные, они дают начало ростковым трубкам, которые проникают через оболочку эпидермальных клеток промежуточного хозяина. Через 4-6 дней в межклеточном пространстве растения возникает кувшинкообразная структура, — пикнида — диаметром 80-100 мкм, в полости которой образуются пикноспоры (1,3х3,1 мкм в диаметре). Эции цилиндрической формы появляются на нижней стороне листьев под пикнидами через 8-10 дней после слияния пикноспор разного знака. Эции имеют цилиндрическую форму, эциоспоры — одноклеточные, округлой формы с бесцветной бородавчатой оболочкой и желтым содержимым. Рассеивание эциоспор происходит за счет ветра и дождя. При попадании на основное растение- хозяина они прорастают и ростковые трубки проникают через устьица в ткани, где развивается дикариотический мицелий, на котором образуются урединиопустулы. В течение вегетационного периода на пшенице гриб может развивать до 10 поколений урединиоспор, служащих основными источниками инфекции. В конце сезона образование урединиоспор прекращается, и на месте урединиопустулы появляется темно-коричневая телиопустула. Телиоспоры служат для перезимовки гриба.

Возбудитель бурой ржавчины пшеницы редко проходит полный цикл развития; чаще он зимует в виде урединиоспор или дикариотического мицелия на озимой пшенице. Гриб может существовать несколько лет в урединиостадиях, а прохождение периодически полного цикла развития обеспечивает генетическую изменчивость и в связи с этим возможность возникновения рас патогена.

P. recondita f. sp. tritici поражает многие виды пшеницы: Triticum aestivum L., T. durum Desf., T. polonicum L., T. cartlicum Nevski, T. turgidum L., T. timopheevi Zhuk., T. dicoccoides Korn., T. compactum Host., T. spelta L., T. vavilovii L., T. sphaerococcum Perc., T. thaoudar Reut., T. macha Dek.et Men., T. dicoccum Schrank, T. orientale L., T. urartu Thum., а также виды эгилопса: Aegilops cylindrical, Ae. squarrosa, Ae. biuncialis, Ae. triuncalis, Ae. crassa, пырея, костра, ячменя, волоснеца, ржи и др. [2].

Существование физиологической специализации внутри вида впервые установили Mains и Gackson в 1921г., они описали 12 физиологических рас гриба, распространенных в США, используя метод дифференциации рас возбудителя бурой ржавчины пшеницы, основанной на выявлении степени восприимчивости к той или иной расе определенного набора сортов. В 1926г. ими был создан набор сортов-дифференциаторов (Malakof, Carina, Brevit, Webster, Mediteranean, Logos, Hussar, Democrat). Расы определяются с помощью интернационального ключа, каждой расе дается номер по международному регистру.

В нашей стране подобные работы были начаты в 1931г. Гешеле Э.Э., Проничевой Л.А., и др. В итоге этих исследований было зарегистрировано 25 физиологических рас бурой ржавчины пшеницы. В течение 10 лет (1931-1941гг.) доминирующими расами являлись 20 и 65. Затем исследования были прерваны войной и возобновились лишь в 1958 году в лаборатории ВИЗР под руководством Федотовой Т.И. В Казахстане и в прилегающих зерновых районах Сибири и Урала подобные работы начались в 1964г.

Дальнейшие исследования показали, что одна и та же раса может быть неидентичной по своим паразитическим свойствам, она состоит из биотипов, а применяемые сорта-дифференциаторы не могут их выделить. Это привело к применению рядом исследователей дополнительных сортов для определения рас, составляющих популяции.