4.2.2 Выделение днк из замороженной крови

Для выделения ДНК из лейкоцитов замороженной периферической крови использовали метод Кюнкеля [53].

Для этого потребовались:

Раствор I 0.32 М Сахароза

10мМ Трис-НСl pH 7.5

5мМ MgCl2

1% Тритон Х-100

Раствор II 0.075М NaCl

0.024М ЭДТА pH 8.0

1×ТЕ-буфер 10мМ Трис-HCl pH 8.0

0.5мМ ЭДТА

Фенол, хлороформ, 10% SDS, протеиназа К

Выделение проводится в течение двух дней.

День 1: все процедуры делаются на льду, центрифугируем при 4^◦С

1. К 0,5 мл крови добавить 1 мл холодного раствора I, перемешиваем переворачиванием.

2. Центрифугировать 5000грт, 10 минут при 4^◦С.

3. Слить надосадочную жидкость, и, не переворачивая, поставить на фильтровальную бумагу и дать стечь (около 1 минуты).

4. К осадку добавить 0,5 мл раствора I и ресуспендировать носиком.

5. Центрифугировать 5000грт, 10 минут при 4^◦С.

6. Повторить п.3-5 несколько раз до получения белого осадка (возможно розоватого) ≈ 2-3 раза.

7. Слить надосадочную жидкость, дать стечь.

8. Добавить 0,465 мл раствора II, 0,025 мл 10% SDS, 0,01 мл протеиназы К и ресуспендировать осадок.

9. Инкубировать ночь, +37^◦С в термостате

День2

1. Добавить 0,5 мл фенола, перемешать аккуратным переворачиванием 5 минут.

2. Добавить 0,5 мл хлороформа, аналогично перемешать.

3. Центрифугировать 6000грт, 10 минут при комнатной t^◦.

4. Отобрать верхнюю водную фазу в другой эппендорф.

5. Добавить 0,5 мл хлороформа, перемешать 5 минут.

6. Центрифугировать 6000грт, 10 минут при комнатной t^◦.

7. Отобрать верхнюю водную фазу в другой эппендорф, считая объем.

8. Добавить 2,5 объема 96% этилового спирта.

9. Ставим на полчаса в - 20^◦С.

10. Центрифугировать 13000грт, 10 минут при комнатной t^◦.

11. Слить спирт.

12. Добавить 0,5 мл 70% этилового спирта, дать постоять 5 минут.

13. Центрифугировать 13000грт, 10 минут при комнатной t^◦.

14. Аккуратно слить спирт, остатки отобрать пипеткой, стенки промокнуть фильтровальной бумагой. Дать высохнуть при комнатной температуре.

15. Добавить 0,2 мл 1×ТЕ-буфер.

Полученную смесь оставляли на 1 сутки при комнатной температуре для растворения ДНК. Качество полученного образца ДНК определяли визуально при проведении электрофореза в агарозном геле.

4.2.3 Электрофоретическое разделение днк в агарозном геле

Электрофорез проводили в горизонтальных блоках 0.8% агарозного геля в аппарате для горизонтального электрофореза.

Состав геля:	0.8% агароза 0.5х ТВЕ буфер 1 мкг/мл этидиум бромид
Электродный буфер:	0.5х буфер ТВЕ
10х буфер ТВЕ:	890 мМ Tris 890 мМ борная кислота (pH 8.0) 20М EDTA

Для приготовления геля смесь компонентов прогревали до полного растворения агарозы, после чего охлаждали до 60°С, добавляли бромид этидия до концентрации 0.5 мг/мл и заливали на горизонтальную платформу размером 80x110мм. Толщина геля составляла 5 мм. Электрофорез проводили при постоянном токе 30 мА. Контроль миграции ДНК осуществляли по флуоресценции комплексов с бромистым этидием при возбуждении флуоресценции с использованием трансиллюминатора.