4.1.1 Реактивы

В ходе работы были использованы следующие реактивы:

1. Реактивы для электрофореза: акриламид (98,5%), персульфат аммония (98,5%), TEMED (99,0%), агароза (99,0%) («Serva»);

2. Соли, кислоты и основания: NaOH, NaCl (99,0%), KCl (ХЧ), H₃BO₃ (ХЧ), CaCl₂, AgNO₃, SDS (99,5%), ЭДТА (>99,0%), Na₂CO₃, Na₂S₂O₃ («Merck»);

3. Органические реактивы и соли: HCOOH, формалин, глицерин (>99,9%), этанол, метанол, изопропанол, фенол, хлороформ, CH₃COOH (ХЧ), PEG-6000, бромистый этидий (98,5%) («ВЕКТОН»); Tris (>99,8%), Triton-X100 (99,0%), 8-оксихинолин, глюкоза, ксиленцианол (99,9%), бромфенол (99,9%), глицин (>99,0%) («Amresco»);

4. Реагенты для полимеразной цепной реакции («Fermentas»);

5. Наборы для рестрикции («SibEnzime»);

6. Наборы для очистки ДНК («Promega»).

Праймеры для получения ПЦР-продуктов каждого из четырех экзонов были подобраны с помощью программы «Oligos» и синтезированы «ЗАО Синтол» (Москва).

Использованные в работе праймеры:

Экзон 1: праймер 1 – 5'-CACAGAAGTCCACTCATTCTTGGCGGG-3',

праймер 2 – 5'-CGTGAATCTTAAATGTAGGAATGGGATGTC-3', размер продукта 139 п.н.;

Экзон2: праймер 1 – 5'-CGTGTCTTCTCTACACCCAGGGCACCG-3',

праймер 2 – 5'-CTGTGGGAGGGTTCTTTGGCAACTTACG-3', размер продукта 178 п.н.;

Экзон3: праймер 1 – 5'-TAACTTAATCCAGACTTTCACACCTTAT-3',

праймер 2 – 5'-CCAAAACCAAAACAACCCTCGAAGGTC-3', размер продукта 203 п.н.;

Экзон4: праймер 1 – 5'-GAAATGGATCTGTCTGTCTT-3',

праймер 2 – 5'-GTGCCTTTCACAGGAATTCTTT-3', размер продукта 284 п.н.

4.1.2 Лабораторное оборудование

Для проведения всех необходимых исследований понадобилось следующее оборудование:

1. Амплификатор «Терцик» («ДНК-технология»);

2. Холодильник лабораторный LRM 630 («Dairei») c температурными пределами -5…+12 °С;

3. Морозильник LF300-ST («Dairei») с температурными пределами -10…-25 °С;

4. Центрифуга «Minispin» («Eppendorf») для пробирок объемом 1,5 мл;

5. Миницентрифуга-вортекс «Microspin» FV 2400 («BioSan»);

6. Шейкер Mini Shaker PSU 2T («BioSan»);

7. Инкубатор с воздушной рубашкой МСО-15АС («Sanyo»);

8. Трансиллюминатор (Vilber Lourmat);

9. Весы Discovery («Ohaus»), 110/0,1 мг;

10. Весы Adventurer Pro («Ohaus»), 810/0,01 г;

11. Программируемый источник питания Эльф-4 («Helicon»);

12. Аппарат для горизонтального электрофореза («Helicon»);

13. Камера для вертикального электрофореза VE-10 («Helicon»);

14. Набор автоматических дозаторов переменного объема 2-20 мкл, 20-200 мкл, 100-1000 мкл, 1000-5000 мкл («LabMate»);

15. Одноразовые наконечники для дозаторов, микропробирки объемом 0,5 и 1,5 мл («Ленпипет», «Axigen»);

16. Штативы для наконечников, микропробирок («Ленпипет»);

17. Лента лабораторная «Parfilm M».

4.2 Методы исследования

4.2.1 Стандартные растворы

Для работы потребовалось приготовление некоторых стандартных растворов:

1. Приготовление 1 л раствора 10×ТВЕ:

- 108 г Tris;

- 55 г Н₃ВО₃;

- 7,5 г ЭДТА.

2) Приготовление 1 М TrisHCl pH=8.0:

- 121,1г Tris;

- 42 мл 6н HCl.