- •Реферат
- •Содержание
- •Введение
- •1 Аналитический обзор
- •Транстиретин
- •1.1.1 Строение и функции ттr
- •1.1.2 Роль мутаций гена ттr в образовании амилоидов
- •1.2 Амилоидоз
- •1.2.1 Представления об амилоидозах
- •1.2.2 Структура амилоида и фибрилл
- •1.2.3 Механизм образования амилоидных фибрилл
- •Общие сведения о кардиомиопатии
- •Методы выявления мутаций
- •Патентный поиск
- •Цель и задачи работы
- •Экспериментальная часть
- •Материалы исследования
- •4.1.1 Реактивы
- •4.1.2 Лабораторное оборудование
- •4.2 Методы исследования
- •4.2.1 Стандартные растворы
- •4.2.2 Выделение днк из замороженной крови
- •4.2.3 Электрофоретическое разделение днк в агарозном геле
- •4.2.4 Выделение и очистка амплификатов из агарозного геля
- •4.2.5 Полимеразная цепная реакция
- •4.2.6 Электрофоретическое разделение продуктов амплификации в 8% полиакриламидном геле (пааг)
- •4.2.7 Окрашивание гелей
- •4.2.7.1 Окрашивание бромистым этидием
- •4.2.7.2 Окрашивание пааг нитратом серебра
- •4.2.8 Анализ конформационного полиморфизма одноцепочечной днк (sscp)
- •4.2.9 Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов
- •Результаты и обсуждение
- •5.1 Результаты
- •4 Экзона гена ttr в 9% пааг
- •2 Экзона гена ttr в 12% пааг
- •5.2 Обсуждение полученных результатов
- •Список использованных источников
- •Приложение а Охрана труда и окружающей среды
- •1 Опасные и вредные производственные факторы
- •1.1 Химические вредные и опасные факторы
- •1.2 Психофизиологические вредные и опасные факторы
- •2 Категория помещения по взрывопожароопасности
- •3 Вентиляционная установка
- •4 Освещение помещения
- •5 Аптечка и ее содержимое
- •6 Меры первой помощи
- •7 Охрана окружающей среды
- •Приложение б Оценка технико-экономических результатов исследования
- •1 Краткое резюме
- •2 Расчет затрат на проведение исследовательской работы
- •2.1 Затраты на сырье, материалы и реактивы
- •2.2 Энергетические затраты
- •2.3 Затраты на заработную плату
- •2.4 Амортизационные отчисления
- •2.5 Смета затрат на проведение научно-исследовательской работы
- •7 Расчет уровня рентабельности и цены нир
5.2 Обсуждение полученных результатов
В ходе дипломной работы удалось обнаружить мутацию только у одного из 60 обследованных пациентов. Эта мутация (с.1679G>A), приводящая к замене V30M в аминокислотной последовательности TTR, обнаружена во втором экзоне гена транстиретина в гетерозиготном состоянии и является самой распространенной и хорошо изученной в мире. Такая замена была идентифицирована во многих популяциях Португалии, Японии и Швеции (тип Андрадэ) [56], также США, Британии и Греции. Она также была найдена в Турции, Бразилии, Франции, и Англии [57]. В России исследования по выявлению мутаций в гене транстиретина ранее проводились только в Отделе молекулярной генетики НИИЭМ СЗО РАМН.
В некоторых литературных источниках говорится, что мутация TTR V30M приводит к развитию полинейропатии, но были описаны случаи, когда у пациентов с такой мутацией наряду с полинейропатией диагностировали и кардиомиопатию [58]. Случаи мутации V30M были подтверждены в нашей лаборатории ранее [54] и в рамках данной дипломной работы. Связь мутации TTR V30M с развитием кардиомиопатии и полинейропатии показана молекулярно-генетическими и иммуногистохимическими методами [59].
Наличие мутаций в гене транстиретина не является достаточным основанием, чтобы утверждать о возникновения амилоидоза, так как транстиретин и без замен в аминокислотной последовательности иногда способен образовывать фибриллы. Чтобы исключить наличие транстиретинового амилоидоза у оставшихся 59 пациентов необходимо провести дополнительные иммуногистохимические исследования.
Развитие кардиомиопатий у остальных больных могло быть вызвано разными причинами, в том числе другими (кроме транстиретина) амилоидогенными белками, которых в настоящее время около 30[27].
Выявление мутаций в гене TTR осуществлялось с целью постановки дифференциального диагноза и прогнозирования возникновения заболеваний у родственников пациента. Данная работа является начальным этапом изучения изменчивости гена транстиретина у пациентов с кардиомиопатиями в Санкт-Петербурге. Исследуя спектр мутаций этого гена, можно разработать методы выявления наиболее распространенных мутаций в данном регионе.
Несмотря на активные поиски средств лечения амилоидозов [60], эффективных способов терапии так и не найдено. Поражения сердца при амилоидозе, как и прионовые болезни, болезнь Альцгеймера и нейродегенеративные амилоидозы, относятся к группе фатальных заболеваний. Поэтому крайне важно разработать методы, позволяющие вовремя диагностировать столь серьезные патологии. Дальнейшее исследование закономерностей аномального фибриллогенеза и выяснение причин развития амилоидозов позволит создать прогрессивные методы постановки диагноза и терапии этих болезней.
Выводы
1 Используя метод Кюнкеля, из лейкоцитов замороженной крови больных были выделены 60 образцов ДНК.
2 С помощью полимеразной цепной реакции получены специфические продукты амплификации каждого из четырех экзонов гена транстиретина у каждого исследуемого пациента.
Произведен поиск мутаций в каждом экзоне гена TTR с помощью анализа конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК (SSCP-анализ).
Идентификацию мутации проводили с помощью анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов и автоматического секвенирования.
5 В результате поиска мутаций в гене TTR у 60 больных кардиомиопатией жителей Санкт-Петербурга была выявлена только одна мутация (с. 1679 G>A) во втором экзоне гена TTR в гетерозиготном состоянии, приводящая к замене V30M в аминокислотной последовательности TTR.