4 Экзона гена ttr в 9% пааг

На электрофореграмме SSCP-анализа продуктов амплификации 2 экзона гена ТТR видны дополнительные зоны однонитевых конформеров ДНК. Их можно заметить на дорожке 1 – это образец ДНК пациента №84, несущий ранее идентифицированную в нашей лаборатории мутацию V30M [54], и на дорожке 3 – образец ДНК исследуемого пациента №37 с найденной мутацией (рисунок 13). Электрофоретическая подвижность однонитевых конформеров ДНК на этих дорожках изменяется одинаковым образом, что, вероятнее всего, свидетельствует о наличии одной и той же мутации у обоих пациентов.

1-3 – образцы ДНК пациентов с мутацией; 2-4 – образцы ДНК

пациентов без мутаций

Рисунок 13 – Электрофореграмма SSCP-анализа продуктов амплификации

2 Экзона гена ttr в 12% пааг

Для подтверждения наличия мутации V30M у пациента №37 был проведен анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ). Если найденная мутация аналогична ранее выявленной (мутация с.1679G>A), то она должна приводить к замене кодона GTG, кодирующего валин (Val) в 30 положении аминокислотной последовательности транстиретина, на кодон ATG, кодирующий метионин (Met).

Подбор эндонуклеаз рестрикции проводили с помощью компъютерных программ Primer Primier 5 и BioEdit v.7.0.1. Была выбрана эндонуклеазой рестрикции MscI.

При обработке продукта амплификации 2 экзона гена TTR с канонической последовательностью длиной 178 п.н. эндонуклеазой рестрикции MscI ферментативного гидролиза не происходит. Замена нуклеотида G на A в положении 1679 приводит к появлению сайта для MscI, и образованию двух фрагментов длиной 96 п.н. и 82 п.н. (рисунок 14).

Рисунок 14 – Схема ферментативного гидролиза канонической последовательности 2 экзона гена TTR и последовательности с мутацией V30M эндонуклеазой рестрикции MscI.

Таким образом, наличие фрагментов длиной 178 п.н., 96 п.н. и 82 п.н. на дорожках 3 и 4 на рисунке 15 говорит о том, что ферментативный гидролиз прошел, что в свою очередь свидетельствует о наличии мутации V30M в гетерозиготном состоянии в последовательности ДНК пациентов №84 и №37.

1 – образец ДНК пациента, не обработанного эндонуклеазой рестрикции MscI, 2 – маркер молекулярного веса с шагом 100 п.н.;

3,4 – образцы ДНК пациентов с мутацией V30M в гетерозиготном состоянии; 5 - образец ДНК пациента без мутации

Рисунок 15 – Детекция мутации V30M (с.1679G>A) в гене TTR с помощью эндонуклеазы рестрикции MscI

Чтобы с уверенностью говорить, что найдена нами мутация во 2 экзоне гена транстиретина соответствует мутации V30M, необходимо было установить нуклеотидную последовательность 2 экзона с помощью автоматического секвенирования по Сэнгеру. Для этого была подготовлена и очищена проба, содержащая продукт амплификации ДНК пациента №37. Данная процедура проводилась в фирме «Евроген» (Москва, www.evrogen.ru).

T G G C C G/A T G C A T

Рисунок 16 – Графические данные автоматического секвенирования последовательности 2 экзона гена TTR, содержащей

мутацию с.1679G>A в гетерозиготном состоянии.

Секвенирование выявило замену с.1679G>A в гетерозиготном состоянии (рисунок 16). Как и подтвердилось, мутация приводит к замене кодона GTG, кодирующего валин в 30-ом положении аминокислотной последовательности транстиретина, на кодон ATG, кодирующий метионин.