4.2.4 Выделение и очистка амплификатов из агарозного геля

Очистку амплификатов проводили по стандартной методике с помощью наборов фирмы «Promega» (Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System, США).

4.2.5 Полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) [51] проводилась в реакционной смеси конечным объемом 30 мкл на 1 пробу.

Состав реакционной смеси:

праймеры (прямой и обратный) 10 мкМ по 0,2 мкл

10×буфер для Taq-полимеразы 3 мкл

dNTP (dATP,dTTP,dGTP,dCTP) 10 мМ 0,6 мкл

MgCl₂ 100 мМ 0,6 мкл

Taq-полимераза 0,5 мкл

ПЦР проводилась в пробирках объемом 0.6 мл на аппарате «Терцик» (Россия) с набором программ, определяющих температурный режим ПЦР.

Температурный профиль ПЦР:

5 минут	95°С	1 цикл
1 минута	95°С (денатурация)		30 циклов
1 минута	55-58°С (отжиг)
1 минута	72°С (достройка)
10 минут	72°С (достройка)		1 цикл

Температура отжига для каждого экзона своя:

1. экзон - 58°С;

2 экзон - 56°С;

1. экзон - 56°С;

2. экзон - 55°С.

4.2.6 Электрофоретическое разделение продуктов амплификации в 8% полиакриламидном геле (пааг)

Для оценки количества и специфичности продуктов амплификации ДНК проводили электрофоретическое разделение этих продуктов в вертикальных пластинах полиакриламидного геля (80х100х2мм). При электрофорезе ДНК в ПААГ в неденатурирующих условиях происходит разделение молекул в зависимости от их размера.

Состав геля:	30% акриламид 1Х буфер ТВЕ 0.1% персульфат аммония 0.08% TEMED
Буфер для образцов:	8% глицерин 0.025% ксиленцианол 0.025% бромфеноловый синий
Электродный буфер:	1Х буфер ТВЕ
1х буфер ТВЕ:	89 мМ Трис 89 мМ борная кислота (pH 8.0) 2 мМ EDTA

Электрофорез проводили при постоянном токе 30 мА.

4.2.7 Окрашивание гелей

4.2.7.1 Окрашивание бромистым этидием

Гель помещали в кювету с водой. Добавляли раствор бромистого этидия до конечной концентрации 0.5 мкг/мл. Окрашивали гель при покачивании в течение 10 минут. Для удаления бромистого этидия, не вступившего в реакцию с ДНК, несколько раз промывали гель водой. Оценивали электрофоретическую подвижность ДНК визуально по интенсивности свечения в проходящем ультрафиолетовом излучении.

4.2.7.2 Окрашивание пааг нитратом серебра

Раствор I: 0,1% раствор нитрата серебра (AgNO3).

Раствор II (проявляющий): на 100 миллилитров

-карбоната натрия (Na2CO3) 3г;

-раствора формальдегида 37% 400 мкл;

-раствора тиосульфата натрия (Na2S2O3) 1% 40 мкл;

-вода до 100 мл.

Проявляющий раствор II готовили непосредственно перед использованием.

Раствор III: 10%-ая уксусная кислота.

Гель фиксировали в растворе III при постоянном покачивании 20 минут. Промывали гель водой при постоянном покачивании 2 раза по 2 минуты. Выдерживали гель в растворе нитрата серебра при постоянном покачивании 30 минут. Промывали гель водой в течение 20 секунд. Проявляли гель в растворе II до нужной степени окраски. Фиксировали окрашивание раствором III.