Способи культивування анаеробних мікроорганізмів
Вирощування у високому шарі середовища. Рідке середовище наливають до країв пробірок чи колб. Перед використанням середовище прогрівають на водяній бані 30-40 хвилин, і швидко охолоджують, щоб не встиг розчинитись кисень. Посівний матеріал вносять на дно пробірки. Пробірки закривають гумовими або скляними пробками. Якщо ріст мікроорганізмів не супроводжується виділенням газів, поверхню середовища заливають стерильним вазеліном або парафіном.
Культивування у в’язкому середовищі. Дифузія кисню у рідину зменшується зі збільшенням її в’язкості. Готують середовище з додаванням 0,5% агар-агару (ущільнювача).
Вирощування у шарі щільного середовища. Посівний матеріал вносять у розплавлене та охолоджене до 45-500С агаризоване середовище. У пробірках поверхню заливають стерильною вазеліновою олією.
Вирощування в анаеростатах. З анаеростатів відкачують повітря, а потім заповнюють сумішшю азоту (80-90%) та вуглекислого газу (10-20%), за рахунок якої створюється надлишковий тиск, який перешкоджає проникненню кисню з повітря.
Щодо відношення мікроорганізмів до світла, то більшості мікроорганізмів воно не потрібно, за винятком фототрофних бактерій.
Практичне завдання та хід роботи:
Розплавити щільні поживні середовища.
Розлити поживні середовища:
пептонну воду у пробірки;
МПА у пробірки (стовпчиком та у вигляді скошеної поверхні) та чашки Петрі.
Засіяти:
штрихом на чашку Петрі з МПА – Staphylococcus aureus;
штрихом у пробірку зі скошеним МПА – Micrococcus luteus;
уколом в стовпчик у пробірку з МПА – Serratia marcescens;
піпеткою у пробірку з пептонною водою – Bacillus subtilis.
Матеріали та обладнання:
Поживні середовища: МПА і пептонна вода; стерильний посуд (3 пробірки і одна чашка Петрі на студента); бактеріологічні петлі (кожному студенту); штативи; культури мікроорганізмів: Staphylococcus aureus; Micrococcus luteus; Bacillus subtilis; Serratia marcescens.
Контрольні питання:
Які умови необхідно забезпечити для нормального вирощування мікроорганізмів?
На які групи поділяються мікроорганізми в залежності від відношення до температури?
Як забезпечити вирощування аеробних та анаеробних форм мікроорганізмів?
Яка техніка посіву на рідкі та щільні поживні середовища?
Поживні середовища
М’ясо-пептонний бульйон (МПБ):
До м’ясної води прибавляють 1% пептону і 0,5% хлориду натрію, кип’ятять протягом 1-2 хв при помішуванні, потім охолоджують і визначають pH.
Внесенням лугу (20%-й NaOH) або 1 н кислоти встановлюють pH середовища 7,6-7,8. Кип’ятять протягом 30-45 хв, охолоджують, фільтрують через паперовий фільтр і доводять об’єм до початкового.
Перевіряють pH, доводять його до 7,2-7,4, розливають у колби і стерилізують при 1200 С протягом 15-20 хв.
М’ясо-пептонний агар:
До виготовлено й охолодженого МПБ прибавляють 1,5-2,0% агар-агару, витримують протягом 15-20 хв при кімнатній температурі (для набухання).
Суміш підігрівають на водяній бані до повного розчинення агар-агару.
Охолоджують до 500 С і для просвітлення вносять у середовище ретельно збитий, у подвійному об’ємі холодної води, яєчний білок (білок 1 яйця на 1 л середовища). Прогрівають в автоклаві при 0,5 атм протягом 45 хв. Білок адсорбує звішені частинки, згортається й осідає на дно.
Середовище фільтрують через шар марлі або вати.
Перевіряють і доводять до необхідного значення pH середовища.
Середовище розливають у колби і стерилізують при 1200 С (1 атм) протягом 15-20 хв.
Пептонна вода (ПВ):
В 1 л дистильованої води розчиняють при нагріванні 100 г пептону, 50 г хлориду натрію, 1 г нітрату калію, і 20 г бікарбонату натрію.
Розчин фільтрують через паперовий фільтр, розливають у колби і стерилізують при 1 атм протягом 30 хв.
Ґрунтовий агар (ГА):
З повітряно-сухого ґрунту видаляють рослинні рештки, кусочки скла та інших домішок.
Ґрунт розтирають у ступці, а потім просівають через сито з діаметром пор 1 мм.
Ґрунт поміщають у колбу і заливають дистильованою водою у співвідношенні 1:5. Суспензію ретельно перемішують, а потім прибавляють 1,5-2,0% агар-агару.
Середовище стерилізують в автоклаві при 1200 С протягом 1 год. Стерилізацію повторюють через 1-2 доби.
Сусловий агар (СА):
Пивне сусло розводять до вмісту цукрів 7-80 за Баллінгом і стерилізують при 1200 С протягом 10 хв.
В 1 л охолодженого сусла прибавляють 1,5-2,0% агар-агару, витримують при кімнатній температурі протягом 15-20 хв, розплавляють середовище на водяній бані, розливають у колби і стерилізують при 1100 С протягом 10 хв.
Середовище Сабуро:
В 1 л водопровідної води вносять 80 г пресованих пекарських дріжджів (або 20 г сухих дріжджів).
Кип’ятять протягом 15 хв, фільтрують через паперовий фільтр.
У холодну дріжджову воду вносять 1,5-2,0% агар-агару і витримують протягом 15-20 хв при кімнатній температурі, а потім плавлять на водяній бані, прибавляючи 1% пептону і 4% глюкози (або мальтози).
Середовище фільтрують через шар вати, розливають у колби і стерилізують при 0,5 атм протягом 20 хв.
Середовище Чапека:
В 1 л водопровідної води внести при перемішуванні:
глюкозу (сахарозу) - 30,0 г
натрій азотнокислий - 2,0 г
калій фосфорнокислий однозаміщений – 1,0 г
магній сірчанокислий – 0,5 г
калій хлористий – 0,5 г
залізо сірчанокисле – 0,01 г
агар-агар – 20,0 г
Середовище стерилізують протягом 10 хв при 116,50 С (0,75 атм) в автоклаві.
Середовище Ендо:
Поживне середовище Ендо випускається у вигляді сухого порошку і готується згідно пропису, вказаного на етикетці.
Середовище Ешбі:
Для виготовлення синтетичного середовища Ешбі, яке призначене для культивування азотфіксуючих бактерій, на 1 л водопровідної води добавляють:
калій фосфорнокислий двозаміщений 0,2 г
магній фосфорнокислий – 0,2 г
калій фосфорнокислий 0,1 г
натрій хлористий – 0,2 г
крейду – 5,0 г
сахарозу – 20 г
агар-агар – 20 г.
Крохмально-аміачний агар:
амоній сірчанокислий – 2,0 г
калій фосфорнокислий двозаміщений – 1,0 г
магній сірчанокислий – 1,0 г
натрій хлористий – 1,0 г
крейду – 3,0 г.
розчинний крохмаль – 10,0 г
агар-агар – 20 г
Крохмаль попередньо розмішують у невеликій кількості води, а потім доливають до основного середовища.