Капиллярная хроматография

Капиллярная хроматография впервые была предложена Голеем в 1957 году.

В методе капиллярной хроматографии используют насадочные колонки, в которые очень плотно набивается активная зона в виде зерен. Часто используют медные колонки, длина их достигает 300 метров. Совершенно очевидно, что набить эту колонку зернами невозможно. Активная зона наносится на внутренние стенки медной колонки, диаметр которой от 0,2 до 0,3 мм. Толщина слоя неподвижной фазы составляет от 0,1 до 0,3 микрометра.

Колонки чаще всего выполняются из металлов, иногда из благородных. Наибольшие успехи достигнуты при применении капиллярных стеклянных колонок, они имеют длину 50-100 м. Цена их составляет около 500 долларов.

Учитывая небольшой размер диаметра капиллярной колонки и тонкий слой неподвижной фазы, из уравнения Ван-Деемтера вытекает, что коэффициент А будет очень мал, так как в этой колонке почти нет вихревых явлений. Коэффициент С тоже мал, так как очень тонкий слой неподвижной фазы. Снижение коэффициента В достигается увеличением скорости газа-носителя до 10-20 см/сек. Главное достоинство капиллярной хроматографии – очень высокое число теоретических тарелок, оно может достигать миллиона. Никакие другие колонки этого числа не дают. ВЭТ для этих колонок может достигать от 0,15 до 2 мм.

При исследовании неизвестного вещества можно получить хроматограмму, состоящую из большого числа пиков. Но идентифицировать удается лишь половину или треть веществ. Причина этого в отсутствии стандартов, необходимых для их идентификации. Надо отметить, что нет другого вида хроматографии, обладающего такими высокими разделительными способностями

,Остановимся на одном из наиболее важных вопросов хроматографии – получение летучих соединений из нелетучих. Можно выделить три основных подхода:

а) вакуумная хроматография,

б) термодеструктивная хроматография,

в) химические реакции.

В вакуумной хроматографии газ-носитель поступает в колонки не из-за того, что его подают под давлением, а потому что на выходе колонки создают вакуум. Глубина вакуума не очень большая –5-10 мм ртутного столба. Это обеспечивает снижение температуры кипения веществ, примерно, на 100⁰С, и таким образом расширяет возможности газохроматографического метода анализа.

В основе термодеструктивной хроматографии лежит разрушение нелетучих и малолетучих веществ в системе ввода пробы под действием высоких температур до более простых летучих соединений. Это возможно не во всех случаях, а лишь в тех, когда термодеструкция идет по какому-то определенному пути, т.е. когда получаются определенные вещества, или хотя бы одно вещество. Тогда по этому веществу можно хроматографировать. Один из примеров – это определение высших четвертичных аммониевых солей. Под действием температуры около 400⁰С они распадаются на третичный амин, алкен и галоид водорода. Понятно, что третичный амин относится к летучим соединениям. Его можно хроматографировать. Еще проще - соответствующий алкен. По алкену или по третичному амину, либо по их сумме можно оценить вещество, которое распалось на те или иные фрагменты.

R (C₁₀ H₂₁)₄ NBr (C₁₀H₂₁)₃ N + C₁₀H₂₀ + HBr

В охране окружающей среды термодеструктивная хроматография часто применяется для анализа пестицидов. Возможно ее применение и в фармацевтической промышленности.

Метод химических реакций является более аккуратным и употребимым методом получения летучих соединений. Например:

1) высшие жирные кислоты (С₁₇), которые кипят слабо, чаще всего переводят в метиловые эфиры:

RCOOH + CH₃ COOH RCOOCH₃

2) высшие спирты переводят в триметилсилиловые эфиры, отличающиеся большой летучестью:

ROH + HO Si (CH₃) ROSi (CH₃)₂

Для спиртов выше С₂₀ – С₃₀ это весьма актуально.

3) еще одна уникальная возможность: перевод сахаров в летучие соединения методом триметилсилилирования. Вы хорошо знаете, что при высоких температурах сахара обугливаются, но не летят.

Если несколько групп -ОН (например, половину) перевести в силильные группы, то образуется летучее соединение, которое можно хроматографировать и таким образом определять.

4) фенолы чаще всего переводят в высшие фенолы или в эфиры.

Сам фенол не имеет смысла переводить в летучее соединение, он и так летуч, а если это будет сложный фенол с длинной цепью заместителя, то это будет актуально:

5) очень интересным и особенно важным для фармацевтов является анализ аминокислот.

А минокислоты переводят в так называемые ТАБ - эфиры. Вначале при комнатной температуре аминокислоты переводят в метиловый эфир:

В следующей стадии замещают метилбутилом:

Затем полученное соединение обрабатывают ангидридом трифторуксусной кислоты:

Эти вещества обладают настолько высокой летучестью, что метиловые эфиры кипели бы при температуре чуть больше 0⁰, поэтому нужны именно бутиловые эфиры. Для аминокислот это обеспечивает температуру удобную для эксперимента.

Понятно, что когда надо анализировать смесь аминокислот биологического происхождения, а их более 20, то никакой другой метод не может сравниться с этим.