II стадия – адсорбция чужеродных клеток наповерхности фагоцита.

Осуществляется в результате:

1-электростатического взаимодействия ЦПМ фагоцита с гидрофобными частицами или положительно заряженной поверхностью чужеродной клетки;

2-рецептор (лиганд) – рецепторного взаимодействия фагоцита с чужеродными клетками (микро-организмы). Этот процесс происходит при участии опсонинов – веществ, облегчающих адсорбцию и поглощение чужеродных клеток: компоненты комплемента, антитела – IgG и IgM.

Рецепторы на поверхности фагоцитов:

1- рецепторы к С3в-компоненту комплемента – СR3в: за счет химического сродства связывают через С3в (опсонин) липополисахариды Грам- микробов, липопротеиды простейших, поверхностные структуры грибов;

2- рецепторы для связывания маннозы (лектина) на поверхности сальмонелл, микобактерий и др. клеток;

3- рецепторы для Fc-фрагментов IgG – через IgG (опсонин) адсорбция различных чужеродных клеток;

4- скавенджер – рецепторы для производных лигандов сиаловых кислот, находящихся на клетках (деградирующие и погибающие собственные клетки) – это рецепторы для «уборки мусора» (“scavenger receptor”).

Чужеродные клетки за счет опсонинов и рецепторов взаимодействуют с мембраной фагоцита по принципу «замка молнии». В фагоцитах активируются метаболические процессы.

III стадия – поглощение чужеродных клеток фагоцитом и образование фаголизосом

ЦПМ обтекает чужеродную клетку – образуется фагосома – мембрана фагосомы сливается с мембраной лизосомы – образуется фаголизосма.

У макрофагов поглотительная способность выражена в большой степени, чем у нейтрофилов.

Клетки врожденного иммунитета:

1. Эозинофил

2. Нейтрофил

3. Базофил

4. Моноцит (тканевой макрофаг и дендритная клетка)

5. Натуральный киллер

1 Стадия – развитие в костном мозге

Макрофаги длительно функционируют в тканях

Экстренная миграция в ткани

Спонтанная миграция в ткани

Нейтрофил быстро погибает

Нейтрофилы, моноциты

Быстрая миграция в ткань

Дендритные

Тучные клетки

Длительная

Кратковременная

2 Стадия – циркуляция в крови

Клетки	Развитие в костном мозге	Циркуляция в крови	Пребывание в тканях
Моноциты	8-9 суток	1-2 сут	20 суток – годы
Нейтрофилы	18-20 суток	7-10 часов	3-5 суток
Эозинофилы	8-10 суток	5-10 часов	10-12 суток

III-IV ст.Активация мембраны и поглощение чужеродного агента

V ст. Формирование фагосомы

VI cт. Фаголизосома

VII стадия – киллинг или внутриклеточное разрушение чужеродных клеток

Выделяют 2 системы цитотоксичности фагоцитов:

1-кислородзависимая

2-кислороднезависимая

В процессе фагоцитоза в фагоцитах происходит серия метаболических измене-ний – «дыхательный» или «кислородный взрыв».

Это сопровождается образованием и накоплением различных веществ:

I. Образование и накопление АФК:

1-увеличение содержания О2 за счет его интенсивного поглощения (в 2-10 раз);

2-образование супероксидного аниона О-2: под действием НАДФ-оксидазы ЦПМ фагоцита и цитохрома b О2 трансформируется в –О2

(НАДФН + 2О2 НАДФ+ + 2О-2 + Н+);

3-образование перекиси водорода – Н2О2: под действием фермента супероксиддисмутазы супероксидный анион трансформируется в Н2О2

(2О-2 + Н2О фермент Н2О2 + О2)

4-образование гидроксильного радикала – ОН- в присутствии ионов Fe2+ супероксид и перекись водорода вступают в реакцию Хабер-Вайса с образованием ОН-

(Н2О2 + О2- Fe О2 + ОН- + ОН-);

5-образование гипохлорита – НClO-: фермент миелопероксидаза в присутствии Н2О2 трансформирует ионы Cl- в ионы гипо-хлорита

(Cl- + Н2О2 фермент 2НClО-).

Миелопероксидаза (МПО) является маркерным белком азурофильных гранул нейтрофилов. Она входит в состав микробицидной миелопероксидазной систе-мы, которая включает в себя окислитель - Н2О2 и кофакторы (I-, Cl-, Br -, SCN-). МПО-система подавляет жизнедеятельность бактерий, грибов, микоплазм и вирусов – универсальный антимикробный фактор.

МПО-система вызывает:

• галогенирование биополимеров (белков, полисахаридов, ненасыщенных жирных кислот):

биополимер+Н2О2+I-+ МПО ОН-+Н2О2+ галогенированный биополимер

Свободный йод переводится в органически связанное состояние. Происходит опосредованное I-окисление сульфгидрильных групп белков, что снижает жизнеспособность бактерий.

6-образование синглетного кислорода – 1О2: при взаимодействии гипохлорита с пере-кисью водорода (Н2О2+ОCl- Cl-+Н2О2+1О2).

Синглентный кислород взаимодействует с полиненасыщенными жирными кислотами фосфолипидов, инициирует их перекисное окисление, что приводит к нарушению целостности ЦПМ;

7-образование радикала оксида азота – NO- за счет активации фермента NO-синтазы.

II. Образование хлораминов за счет взаимодействия гипохлорита с пептидами фагоцита.

МПО-система при использовании хлорида окисляет сначала ионы Cl- до катиона в составе гипохлоритного аниона (ОCl-)

Н2О2+Cl- +Н+ МПО НОCl-+Н2О

НОCl взаимодействует в кислой среде с амино-кислотами (аспарагиновой, аланином, серенином, лизином) с образованием соответствующих хлораминов.

Хлорноватистая кислота способна реагировать с пептидными связями в микробных белках в результате чего образуются хлорамиды.

Хлорамиды в свою очередь гидролизуются с разрушением пептидной связи и формированием NCl-пептидов, которые окисляют компоненты микроба и усиливают их структурные нарушения.

Хлорамины аминокислот под действием воды разлагаются до альдегидов, которые являются «когтями и клыками» (А.Сент-Дьердьи, 1971) макроорганизма в защите от инфекционных агентов, так как они активно реагируют с функционально важными группами чужеродных молекул (-SH, -NH2, -OH), лишая их биологической активности: гипохлорит блокирует функционирование дыхательной цепи бактерий.

III. Образование молочной кисло-ты и снижение рН от 6,5 до 3,0 внутри фагосом в результате активизации гликолитического пути метаболизма углеводов в фагоците.

Данные процессы обусловливают следующие эффекты в поглощенных чужеродных клетках:

• перекисное окисление мембранных липидов;

• инактивация ферментов и деградация белков за счет разрушения пептидных связей;

• подавление синтеза РНК и ДНК.

Нарушается структурная целостность чужеродных клеток, разрушаются основные их биомолекулы (ДНК, РНК, белки, липиды, полисахариды), что в конечном итоге приводит к их лизису.

Различают:

1. Завершенный фагоцитоз, когда поглощение заканчивается полным разрушением чужерод-ных частиц;

2. Незавершенный фагоцитоз, когда поглощенные частицы сохраняются в фагосомах.

Персистирование связано с 3 механизмами:

1. блокада фаголизосомального слияния (вирусы, микобактерии, простейшие).

2. резистентность к лизосомальным ферментам (гонококки, стафилококки)

3. способность м/о покидать фагосомы после поглощения и сохраняться в цитоплазме (риккетсии).

Функции фагоцитов

• Удаление из организма отмирающих и поврежденных клеток

• Поглощение и инактивирование микробов

• Презентация АГ Т-хелперам (антиген-презентирующая функция)

• Участие в регуляции иммунной системы, синтез биологически активных веществ

• Удаление неметабилизируемых неоргани-ческих веществ (частички угля, пыли и др.)

Кислороднезависимая система инактивации микроорганизмов при фагоцитозе

Определяет действие на чужеродные клетки различных биологически активных веществ.

Антибиотические пептиды:

1. Дефенсины (HNP1-3) – лизосомальные катионные белки, локализованы в азурофильных гранулах нейтрофилов (α-дефенсины). Они содержат аминокислоты с гидрофобными боковыми цепями (изолейцин, пролин, лейцин, валин); 6 остатков цистеина с тремя дисульфидными мостиками, что придает пептиду повышенную устойчивость к протеиназам нейтрофилов и очагов воспаления. В таком виде они являются активными мембранотропными веществами: взаимодействуют с фосфолипидами, внедряются в липидный бислой чужеродных клеток. Обладают активностью в отношении микробов, оболочных вирусов, опухолевых клеток.

2. Кателицидины – положительно заряженные пептиды, тропные к мембранам микроорганизмов, являются ингибиторами катепсина L. Обладают активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных микробов, грибов, сложных вирусов.

Механизм действия:

Как положительно заряженные пептиды взаимодействуют с отрицательно заряженными молекулами оболочек чужеродных клеток – фософлипидами ЦПМ, ЛПС, тейхоевыми кислотами, кислыми белками, пептидогликанами. Благодаря элекростатическому взаимодействию происходит сорбция петидов на поверхности микробных клеток.

При взаимодействии с наружной и цитоплазматической мембраной образуются димеры дефенсинов, которые внедряются в эти бислои мембран и увеличивают их проницаемость.

Процесс внедрения и прохождения катионных белков через ЦПМ сопровождается нарушением ее целостности с образованием пор.

В результате

• изменяется осмотический барьер, вода накапливается в клетках происходит разрыв клетки

• происходит вытекание жизненно важных компонентов (ионов К+, Са2+, аминокислот, нуклеотидов, ферментов и др.), деполяризация мембранного потенциала.

• дезорганизация мембранных мультиферментных комплексов приводит:

• к подавлению дыхания, синтеза белков,

• репликации нуклеиновых кислот.

В результате происходит гибель микроорганизмов.

Лактоферрины (ЛФ) – железосвязывающие гликопротеины представлены одноцепочечными белками с мол.массой около 80 Кда. Содержатся в гранулах нейтрофилов.

ЛФ представляют собой природные комплексоны, прочно связывающие катионы металлов переменной валентности (Fe3+, Cr3+, Co3+, MnO3, Cd2+, Zn2+, Ni2+), чаще взаимодействует с ионами Fe, Cu и Zn.

Реакция связывания ионов Fe протекает с обязательным участием бикарбонатных анионов:

2 Fe2+ + 2НСО3- + ЛФ(Н3)2 → ЛФFe2(НСО3)2 + 6Н2+

Комплексообразующая способность ЛФ лежит в основе их детоксицирующей, транспортной и антимикробной функций. Связывая ионы металлов ЛФ лишает поверхностные стуктуры микроорганизмов жизненно важных микроэлементов, входящих в состав цитохромов дыхательной цепи, каталаз, пероксидаз, супероксиддисмутаз, сдерживая рост и размножения микробов и грибов – оказывает бактериостатическое действие.

Насыщенный железом ЛФ уже не проявляет микробостатической активности. Отсюда важно именно связывание и удерживание Fe.

ЛФ оказывает прямое бактерицидное действие на стрептококки, холерный вибрион, синегнойную палочку (ненасыщенный железом ЛФ – аполактоферрин):

• происходят изменения в структуре микробных клеток – высвобождение ЛПС из наружной мембраны клеточной стенки за счет связывания ионов Ca2+ u Mg2+, выпадение кето- дезоксиоктоновой кислоты из ЛПС;

• активируются литические ферменты ЦПМ (фосфолипазы, гликаназы) – аутолиз микробных клеток;

• образуются короткие катионные пептиды из ЛФ за счет ограниченного протеолиза, которые проникают в КС и ЦПМ микробов, образуют поры, происходит их осмотический лизис.

ЛФ обладает способностью стимулировать NK-клетки, нейтрофилы и макрофаги.

Бактерицидный проницаемость увеличи-вающий белок (БПУ-белок или холобелки):

Содержится в азурофильных гранулах нейтрофилов

Белки с мол. весом 50-60 кДа, богатые гидрофобными аминокислотами. Они состоят из катионной лизин-обогащенной N-концевой части и гидрофобной слабо заряженной С-концевой половины, их соединяет гидрофильный пролин-богатый участок.

Ингибирует рост и размножение многих видов грамотрицательных, в том числе капсулообразую-щих микробов. Не оказывает цитотоксического действия на грамположительные микробы и эукариотические клетки.

Цитотоксическое действие реализуется в 2 стадии:

1 стадия – при нейтральных значениях рН БПУ-белок в течении первых минут обратимо подавляет размножение микробов за счет связывания с белком наружной мембраны и активацией литических ферментов (фосфолипазы А2, пептидогликаназы) КС. Наблюдаются структурные изменения в КС. Кроме того, N-концевая часть молекулы БПУ-белка обладает высоким положительным зарядом и гидрофобностью обеспечивает повышенное сродство белка к ЛПС наружной мембраны КС, блокируют основные ЛПС-опосредованные эффекты и обладает эндоток-синсвязывающей способностью.

2 стадия – необратимая – лизис микробных клеток.

Катионный холобелок электростатически связывается с поверхностными областями КС, идет конкурентное вытеснение ионов Са2+ и Мg2+ из наружной мембраны. Повышается ее проницае-мость, обнажаются ее гидрофобные области, с которыми взаимодействует гидрофобный С конец БПУ-белка. Образуются поры, через которые из микробных клеток происходит утечка жизненно важных элементов и молекул. Кроме того, за счет активации литических ферментов происходит разрушение фосфолипидов мембран и пептидогликанового скелета; блокируются транспортные и энергетические процессы.

Серпроцидины

1. Катепсин G – это сериновая протеаза с оптимальной ферментативной активностью в нейтрально-щелочной среде, содержится в гранулах нейтрофилов и моноцитов (макрофагов, характеризуется положительным зарядом своих молекул.

Доказана антимикробная активность в отно-шении грамположительных и грамотрицательных микробов, грибов.

Катепсин G является поверхностно активным веществом и как катионный белок

• нарушает функции КС,

• подавляет синтез белка,

• ДНК- и РНК-молекул в микробной клетке,

• Резко снижает функции ЦПМ, в частности, энергетический метаболизм.

2. Эластаза.

Локализована в азурофильных гранулах нейтрофилов; может высвобождаться в фагосому и во внеклеточное пространство.

Это катионный гликопротеин с активностью сериновой протеиназы. Проявляет оптимальную ферментативную активность при рН=8-9.

Обладает способностью расщеплять эластин, коллаген, фибрин, фибриноген, гемоглобин, протеогликаны, кининогены, компоненты комплемента.

Эластаза вызывает субклеточные изменения в структуре клеточных оболочек бактерий, повышает их чувствительность к воздействию МПО-системы, катепсин G и БПУ-белка.

Доказана переваривающая активность эластазы в отношении некоторых белков наружной мембраны грамотрицательных микробов.

3. Азуроцидин (белок САР37)

• катионный белок в азурофильных гранулах нейтрофилов,

• избирательно активен в отношении грамотри-цательных бактерий,

• гликопротеин с тремя потенциальными сайтами гликозилрования, мол. вес 25-29 кДа,

• вместе с эластазой и катепсином G инактивирует бактерии ротовой полости,

• действует в кислой среде,

• нарушает функцию ЦПМ микробов.

Лизоцим (мурамидаза, мукопептидгликогид-ролаза)

• содержится в гранулах нейтрофилов и макрофагов,

• является катионным белком с низким молекулярным весом около 15 кДа,

• механизм действия: гидролизует 1,4 β-связи между остатками N-ацетилмурамовой кислотой и N-аце-тилглюкозамином,

• может осуществлять полное растворение пептидо-гликанового слоя, в результате чего образуются сферо- и протопласты. Последние лизируются за счет разрыва ЦПМ, не выдерживающей высокого осмо-тического давления,

• реализация бактерицидного эффекта происходит в присутствии других активных веществ (дефенсины, БПУ-белка и др.), которые в процессе дегрануляции оказываются в фаголизосомах, изменяют структуру КС и делают ее чувствительной к лизоциму.