Лабораторные работы

1.Ферментативный метод определения содержания холестерина в сыворотке крови.

Принцип метода. Холестерин и его эфиры выделяются из липопротеинов крови детергентами. Эфиры холестерина гидролизуются с участием холестеролэстеразы:

Эфиры холестерина + Н₂О холестерин + жирные кислоты

Холестерин окисляется холестеролоксидазой в присутствии кислорода воздуха:

Холестерин + О₂ холестерин + Н₂О₂

Образовавшаяся перекись водорода (Н₂О₂) взаимодействует с 4-амино­антипирином при участии пероксидазы в присутствии фенола:

Фенол + 4-аминоантипирин + Н₂О₂ хинонимин + Н₂О

Образуется окрашенное вещество хинонимин, по интенсивности окраски которого судят о количестве холестерина в исследуемом образце.

Ход работы. К 2 мл раствора, содержащего смесь ферментов, добавить 0,02 мл исследуемой сыворотки крови. Перемешать, инкубировать 30 мин. при комнатной температуре. Затем добавить 1 мл хромогена, содержащего 4-аминоантипирин 0,7 ммоль/л и фенол 2 ммоль/л. Развивается красная окраска, интенсивность которой измеряется на ФЭКе при 500 нм в кювете 1 см.

Расчет: .

А_{стандарт} = 0,3, это степень поглощения стандартного раствора холестерина в концентрации 5,17 ммоль/л (2 г холестерина в 1 л раствора). В норме в сыворотке крови содержится 3,9 – 5,18 ммоль/л холестерина.

Клиническое значение. Увеличение концентрации холестерина отмечается при врожденной гиперлипопротеидемии, а также при приобретенной (вторичной) гиперлипопротеидемии, отмечается при ишемической болезни сердца (ИБС), заболеваниях печени, почек (ХПН), злокачественных опухолях поджелудочной железы, гипотиреозе, сахарном диабете.

Снижение концентрации холестерина обнаружено при злокачественных опухолях печени, гипертиреозе, нарушениях всасывания, нарушениях питания, при обширных ожогах, хронических обструктивных ожогах, хронических обструктивных заболеваниях легких.

ХС_ЛВП и концентрация общего холестерина используются для определения коэффициента атерогенности, по которому судят о вероятности атеросклероза:

2. Качественная проба на холестерин.(проба Сальковского)

Принцип метода: После гомогенизации мозга с сернокислым кальцием из него извлекают холестерин хлороформом.

Ход работы: Тщательно растереть в ступке 0,5 г мозга с двумя частями прокаленного сернокислого кальция. Размазать шпателем густую массу тонким слоем по стеклянной пластинке и высушить в сушильном шкафу при 40 С . Сухую массу соскоблить в сухую ступку . растереть и принести в сухую пробирку .К полученному порошку прибавить 30-40 капель хлороформа и содержимое пробирки взбалтывать в течение 5-10 мин. После отстаивания осадка жидкость отфильтровать в сухую пробирку через сухой фильтр.

С полученным фильтратом проделать качественную пробу на холестерин (реакция Сальковского). Химизм реакции обусловлен дегидратацией и превращением холестерина из вторичного спирта в непредельный углеводород. К 10 каплям фильтрата добавить 8-9 капель концентрированной серной кислоты и осторожно перемешать содержимое пробирки путем встряхивания. Когда жидкость расслоится, верхний хлороформенный слой будет окрашен в красный цвет.