4. Реакции осаждения белков

Белки в растворе и соответственно в организме сохраняются в нативном состоянии за счет факторов устойчивости, к которым относятся заряд белковой молекулы и гидратная оболочка вокруг нее. Удаление этих факторов приводит к склеиванию молекул белков и выпадению их в осадок. Осаждение белков может быть обратимым и необратимым в зависимости от реактивов и условий реакции. В клинической лабораторной практике реакции осаждения используют для выделения альбуминовой и глобулиновой фракций белков плазмы крови, количественной характеристики их устойчивости в плазме, обнаружения белков в биологических жидкостях и освобождения от них с целью получения без белкового раствора.

Обратимое осаждение.

Под действием факторов осаждения белки выпадают в осадок, но после прекращения действия (удаления) этих факторов белки вновь переходят в растворимое состояние и приобретают свои нативные свойства. Одним из видов обратимого осаждения белков является высаливание.

Высаливание. Насыщенным раствором сульфата аммония осаждается альбуминовая фракция белков, полунасыщенным раствором - глобулиновая фракция.

Сущность реакции заключается в дегидратации молекул белка.

Необратимое осаждение белков.

Необратимое осаждение белков связано с глубокими нарушениями структуры белков (вторичной и третичной) и потерей ими нативных свойств. Такие изменения белков можно вызвать кипячением, действием концентрированных растворов минеральных и органических кислот, солями тяжелых металлов.

Осаждение при кипячении.

Белки являются термолабильными соединениями и при нагревании свыше 50-60 градусов С денатурируются. Сущность тепловой денатурации заключается в разрушении гидратной оболочки, разрыве стабилизирующих белковую глобулу связей и развертывании белковой молекулы. Наиболее полное и быстрое осаждение происходит в изоэлектрической точке (когда заряд молекулы равен нулю), поскольку частицы белка при этом наименее устойчивы. Белки, обладающие кислыми свойствами, осаждаются в слабокислой среде, а белки с основными свойствами - в слабощелочной. В сильнокислых или сильнощелочных растворах денатурированный при нагревании белок в осадок не выпадает, т.к. его частицы перезаряжаются и несут в первом случае положительный, а во втором - отрицательный заряд, что повышает их устойчивость в растворе.

Осаждение концентрированными минеральными кислотами.

Концентрированные кислоты (серная, хлористоводородная, азотная и др.) вызывают денатурацию белка за счет удаления факторов устойчивости белка в растворе (заряда и гидратной оболочки). Однако при избытке хлористоводородной и серной кислоты выпавший осадок денатурированного белка снова растворяется. По-видимому, это происходит в результате перезарядки молекул белка и частичного их гидролиза. При добавлении избытка азотной кислоты растворения осадка не происходит. Вот почему для определения малых количеств белка в моче при клинических исследованиях применяется азотная кислота.

Осаждение органическими кислотами.

Трихлоруксусная кислота осаждает только белки, а сульфосалициловая осаждает не только белки, но и высокомолекулярные пептиды. Сульфосалициловой кислотой пользуются при определении белка в моче.

осадок белка.

Осаждение белка солями тяжелых металлов.

Белки при взаимодействии с солями свинца, меди, ртути, серебра и других тяжелых металлов денатурируются и выпадают в осадок. Однако при избытке некоторых солей наблюдается растворение первоначально образовавшегося осадка. Это связано с накоплением ионов металла на поверхности денатурированного белка и появлением положительного заряда на белковой молекуле.

5Различают обратимое и необратимое (денатурация) осаждение белков. Обратимое осаждение проводится высокими концентрациями нейтральных солей (высаливание), спиртом, ацетоном (при низкой температуре и кратковременном действии).

При денатурации происходит разрушение нативной структуры белковой молекулы, что проявляется уменьшением или полной потерей его растворимости, изменением химических свойств, потерей специфической биологической активности. Денатурация не сопровождается разрушением первичной структуры белка, но является необратимым процессом. Денатурирующее влияние проявляют катионы тяжелых металлов, органические кислоты (три-хлоруксусная, сульфосалициловая), танин, концентрированные минеральные кислоты, нагревание, ультрафиолетовый свет, ионизирующее излучение. Явление денатурации широко используется на практике. Так, денатурированные белки лучше подвергаются действию протеолитических ферментов. При денатурации теряется биологическая активность белков (происходит инактивация ферментов, гормонов, вирусов). При отравлении солями тяжелых металлов используют молоко (казеиноген, содержащийся в нем, связывает эти соединения). Под действием соляной кислоты в желудочном соке происходит денатурация белков пищи, в результате чего они теряют тканевую и видовую специфичность и быстрее гидролизуются.

3Б и у р е т о в а я р е а к ц и я. К раствору белка добавляют равный объем 10% раствора едкого натра и затем по каплям 0,1% раствор сернокислой меди. Жидкость приобретает фиолетовое окрашивание, переходящее в красное, если, наряду с белками , имеются альбумозы и пептоны. Реакция обусловлена наличием в белковой молекуле группировок —CO—NH, т.е. пептидных связей. Продукты гидролиза белка ( аминокислоты и амиды) после достаточного разбавления этого эффекта не дают эффекта и потому биуретовой реакцией можно пользоваться для установления конца гидролиза белка. Появление сине-фиолетового окрашивания при описанной реакции обусловлено образованием Сu—Na – комплексной соли биурета. Следует избегать прибавления избытка медного купароса, так как голубая получающегося гидрата окиси меди может маскировать реакцию. Кроме белков, биуретовую реакцию дают: биурет (NH2—СО—HN—СО—NH2), оксамид (H2N—СО—СО—NH2), глицинамид (H2N—СH2—СО—NH2),малонамид (H2N—СО—СH2—СО—NH2), а также следующие аминокислоты а достаточно концентрированных растворах: гистидин, серин и треонин. Таким образом, биуретовая реакция не является строго специфичной для полипептидных цепей. Присутствие в исследуемом растворе MgSO4 и (NH4) 2SO4 препятствует биуретовой реакции. Приналички аммонийных солей следует употреблять большой избыток едкой щелочи.

Н и н г и д р и н о в а я р е а к ц и я. К 3мл нейтрального водного раствора белка добавляют 1 мл свежеприготовленного 0,1% раствора нингидрина(трикетогидринденгидрата); Смесь нагревают до кипения и через минуту охлаждают. Появляется синее окрашивание. Объясняется это ем, что нингидрин дает окрашивание(обычно синее) с любой α- аминокислотой, а так как любой белок содержит α-аминокислоты, то нингидриновая реакция получается со всеми без исключения белками. Химизм реакции можно представить в следующем виде:

Восстановленный нингидрин с аммиаком и второй молекулой нингидрина образует окрашенный в синий цвет продукт конденсации. Нужно иметь в виду, что аммонийные соли и β-аланин также дают положительную нингидриновую реакцию. Добавление аскорбиновой кислоты повышает чувствительность реакции.

К с а н т о п р о т е и н о в а я р е а к ц и я. К раствору белка приливают концентрированной азотной кислоты(уд. вес. 1,4); при этом белок выпадает в осадок. При нагревании осадок частью растворяется и жидкость окрашивается в желтый цвет. При этом происходит образование нитросоединений циклических аминокислот: тирозина и триптофана, которые содержатся в подавляющем большинстве белков. Если полученный желтый раствор охладить, а затем осторожно добавить немного раствора едкой щелочи или аммиака, то появляется красновато-оранжевое окрашивание, обусловленное образованием солей нитроновых кислот.

Р е а к ц и я А д а м к е в и ч а. Аминокислота триптофан в кислой среде, взаимодействуя с альдегидами кислот, образует продукты конденсации красно-фиолетового цвета. К одной капле белка прибавляют 10 капель уксусной кислоты. Наклонив пробирку, осторожно по стенке добавляют по каплям 0,5 мл серной кислоты так, чтобы жидкости не смешивались. При стоянии пробирки на границе жидкостей появляется красно-фиолетовое кольцо.

Р е а к ц и я Ф о л я. Аминокислоты, содержащие сульфгидрильные группы - SH, подвергаются щелочному гидролизу с образованием сульфида натрия Na2S. Последний, взаимодействуя с плюмбитом натрия (образуется в ходе реакции между ацетатом свинца и NaOH), образует осадок сульфида свинца PbS черного или бурого цвета. К 5 каплям раствора белка прибавляют 5 капель реактива Фоля и кипятят 2-3 мин. После отстаивания 1-2 мин. появляется черный или бурый осадок.

6 Денатурация белка. При разрыве большого числа связей, стабилизирующих пространственную структуру белковой молекулы, упорядоченная, уникальная для каждого белка конформация пептидной цепи нарушается, и молекула целиком или в значительной части принимает форму случайного беспорядочного клубка (случайного в том смысле, что каждая молекула данного индивидуального белка по конформации может отличаться от всех других молекул).

Такое изменение белка называют денатурацией. Денатурацию можно вызвать нагреванием до 60-80 °С или действием других агентов, разрушающих нековалентные связи в белках. Денатурация происходит на поверхности раздела фаз, в кислых или, наоборот, щелочных средах, при действии ряда органических соединений — спиртов, фенолов и др.; часто для денатурации применяют мочевину или гуанидинхло-рид. Эти вещества образуют слабые связи (водородные, ионные, гидрофобные) с аминогруппами или карбонильными группами пептидного остова и с некоторыми группами радикалов аминокислот, подменяя собственные внутримолекулярные водородные связи в белке, вследствие чего вторичная и третичная структуры изменяются.Устойчивость к денатурирующим агентам в большой мере зависит от наличия дисульфидных связей в молекуле белка. В ингибиторе трипсина (панкреатический белок) есть три S — S-связи. Если их восстановить, то происходит денатурация без других денатурирующих воздействий. Если затем белок поместить в окислительные условия, в которых происходит окисление SH-групп цистеина и образование дисульфидных связей, то исходнаяконформация восстанавливается. Даже единственная дисульфидная связь существенно повышает стабильность пространственной структуры.

Денатурация обычно сопровождается снижением растворимости белка; при этом часто образуется осадок «свернувшегося белка», а если концентрация белков в растворе достаточно велика, то «свертывается» вся масса раствора, как это происходит при варке куриного яйца. При денатурации утрачивается биологическая активность белков. На этом основано применение водного раствора фенола (карболовая кислота) в качестве антисептика.

Лабильность пространственной структуры белков и большая вероятность их денатурации при разнообразных воздействиях создают значительные затруднения при выделении и изучении белков, а также при их использовании в медицине и промышленности.

В определенных условиях при медленном охлаждении раствора денатурированного нагреванием белка происходит ренативация — восстановление исходной (нативной) конформации (см. рис. 1.20, 4). Это подтверждает, что характер укладки пептидной цепи определяется первичной структурой белка. Процесс образования нативнойконформации белка самопроизвольный, т. е. эта конформация отвечает минимуму свободной энергии молекулы. Можно сказать, что пространственная структура белка закодирована в аминокислотной последовательности пептидных цепей. Это означает, что все идентичные по чередованию аминокислот полипептиды (например, пептидные цепи миоглобина) будут принимать идентичную же конформацию. Однако из этого правила есть исключения. Капсид (оболочка) вируса кустистости томатов содержит белок, построенный из субъединиц А, В и С; первичная структура этих субъединиц идентична, а конформация различна. Известны идентичные олигопептидные последовательности (около 5 аминокислотных остатков), которые в одних белках образуют а-спирали, в других — р-структуры. Таким образом, нативнаяконформация каждого участка пептидной цепи зависит не только от его первичной структуры, но и от ближайшего окружения.

Белки, имеющие одинаковую или почти одинаковую конформацию, могут существенно различаться по первичной структуре. Например, миоглобин, а-прото-меры и [3-протомеры гемоглобина имеют почти одинаковую конформацию (см. рис. 1.9), но их первичная структура заметно различается: примерно в 70 % позиций аминокислоты не совпадают. Однако в таких случаях несовпадающие аминокислоты, как правило, сходны по физико-химическим свойствам боковых цепей