24.Механизм действия ферментов

Различают три стадии в механизме ферментативного катализа:

- образование фермент-субстратного комплекса;

- образование комплекса «фермент-продукт реакции»;

- отщепление продуктов реакции от фермента.

Первая стадия фермент отличается от белка наличием АЦ — участка, с помощью которого фермент соединяется с субстратом и ускоряет реакцию. Долгое время считали, что между ферментом и субстратом имеется точное соответствие («ключ к замку»). Однако сейчас принято считать, что АЦ фермента приспосабливается к субстрату в ходе реакции (теория вынужденного соответствия). В АЦ имеются якорные участки, за счет которых субстрат закрепляется. Каталитический участок АЦ ответственен за тип ускоряемой реакции

Вторая стадия – функционально-активные группы АЦ фермента действуют на субстрат, дестабилизируя связи в нем, вызывая изменение конфигурации субстрата, поляризацию его молекулы, растяжение связей и т.д. Это приводит к химическому преобразованию субстрата (т.е. к протеканию реакции) и образованию продуктов реакции, которые некоторое время находятся в связи с ферментом

Третья стадия – от нее зависит скорость реакции. Происходит отделение фермента от продуктов реакции

Скорость ферментативной реакции зависит от концентрации субстрата [[S]] и количества присутствующего фермента. Эти величины определяют, сколько молекул фермента соединится с субстратом, и именно от содержания фермент-субстратного комплекса зависит скорость реакции, катализируемой данным ферментом. В большинстве ситуаций, представляющих интерес для биохимиков, концентрация фермента очень мала, а субстрат присутствует в избытке. Кроме того, биохимики исследуют процессы, достигшие стационарного состояния, при котором образование фермент-субстратного комплекса уравновешивается его превращением в продукт. В этих условиях зависимость скорости (v) ферментативного превращения субстрата от его концентрации [[S]] описывается уравнением Михаэлиса - Ментен:

где KM - константа Михаэлиса, характеризующая активность фермента, V - максимальная скорость реакции при данной суммарной концентрации фермента. Из этого уравнения следует, что при малых [[S]] скорость реакции возрастает пропорционально концентрации субстрата. Однако при достаточно большом увеличении последней эта пропорциональность исчезает: скорость реакции перестает зависеть от [[S]] - наступает насыщение, когда все молекулы фермента оказываются занятыми субстратом. Выяснение механизмов действия ферментов во всех деталях - дело будущего, однако некоторые важные их особенности уже установлены. Каждый фермент имеет один или несколько активных центров, с которыми и связывается субстрат. Эти центры высокоспецифичны, т.е. "узнают" только "свой" субстрат или близкородственные соединения. Активный центр формируют особые химические группы в молекуле фермента, ориентированные друг относительно друга определенным образом. Происходящая так легко потеря ферментативной активности связана именно с изменением взаимной ориентации этих групп. Молекула субстрата, связанного с ферментом, претерпевает изменения, в результате которых разрываются одни и образуются другие химические связи. Чтобы этот процесс произошел, необходима энергия; роль фермента состоит в снижении энергетического барьера, который нужно преодолеть субстрату для превращения в продукт. Как именно обеспечивается такое снижение - до конца не установлено.

15 и 18Белковый спектр характеристика белкового состава плазмы крови и количественного соотношения отдельных белковых фракций; определение Б. с. помогает диагностировать отдельные виды гипо- и гиперпротеинемий, а также заболевания, не сопровождающиеся изменением общего содержания белка в плазме крови.

Общий белок и белковый спектр крови - это группа показателей, которые отражают способность печени и клеток иммунной системы к выработке определенных белков. Общий белок крови состоит из так называемых альбумина и глобулинов. Печень синтезирует альбумин. Эта способность уменьшается при повреждении печеночных клеток, и тогда в анализе белкового спектра отмечается снижение уровня альбумина. Степень снижения соответствует глубине поражения печени: наибольшие отклонения этого показателя характерны для цирроза. При циррозах и аутоиммунных гепатитах увеличиваются концентрации глобулинов, которые вырабатываются иммунными клетками. Оговоримся, что существует множество причин для различных изменений белкового спектра крови, не связанных с патологией печени, но анализ этих показателей при вирусных гепатитах может существенно помочь определиться со стадией поражения печени в тех случаях, когда по каким-либо причинам проведение пункционной биопсии затруднено.

Исследование изменений белкового спектра имеет значение при воспалительных процессах в нервной системе. Обнаруживаемые изменения не являются строго специфическими и не имеют дифференциально-диагностического значения, но позволяют уточнить стадию и активность воспалительного процесса.

Исследование белкового и липопротеинового спектра сыворотки крови особенно значимо для диагностики патологических состояний, сопровождающихся нарушениями обмена белков и дислипопротеидемиями. При многих заболеваниях в сыворотке крови изменяется соотношение отдельных белков (диспротеинемия), хотя общее содержание белка может остаться нормальным.

В настоящее время известно более 150 индивидуальных сывороточных белков; значительную часть из них можно количественно определить современными иммуноферментными, иммунохемилюминесцентными и иммунотурбидиметрическими методами. Вместе с тем типовые сдвиги белкового состава сыворотки крови можно определить гораздо более доступным электрофоретическим методом, который к тому же позволяет "одним взглядом" оценить общую картину белкового спектра и получить значимую диагностическую информацию.

Принцип электрофоретического разделения молекул состоит в их движении с различной скоростью в постоянном электрическом поле. Наиболее часто в клинической практике используется электрофорез на поддерживающих средах-носителях – хроматографической бумаге, ацетатцеллюлозных мембранах, различных гелях, а также на комбинированных средах. Электрофорез на бумаге до недавнего времени широко применялся во многих лабораториях, однако он имеет много недостатков. Основной из них – в том, что результаты фракционирования белков этим методом могут быть получены лишь на 2-3 день исследования. Электрофорез в агарозном, крахмальном и особенно в полиакриламидном геле дает существенно лучшие результаты, позволяя идентифицировать большее количество белковых фракций сыворотки (до 30), но и ему присущи недостатки – сложность приготовления геля или дороговизна готовых гелевых пластин. Использование мембран из ацетата целлюлозы позволяет достигнуть компромисса и использовать их главные особенности - однородность материала, очень малую емкость слоя, требующую микроколичеств пробы (0,4–2,0 мкл), быстроту разделения и окраски белков (20-80 мин), легкость отмывания фона, а также относительно низкую стоимость пленок и их доступ-ность. В целом применение ацетатцеллюлозных мембран позволяет повысить четкость фракционирования и значительно сократить время, требуемое для разделения, окраски и анализа.

25 Активаторы и ингибиторы действия ферментов. Специфические и неспецифические эффекторы

В клетке на активность ферментов оказывают влияние эффекторы - вещества, ускоряющие (активаторы) или тормозящие (ингибиторы) активность ферментов.

Среди активаторов различают:

1. Неспецифические - усиливающие активность целой группы ферментов. Часто такую роль выполняют ионы. Так, ионы магния - активаторы всех фосфатаз.

2. Специфические активаторы - вещества, активирующие только определенный фермент. Например, Мп активирует только изоцитратдегидрогеназу, соли желчных кислот - липазу сока поджелудочной железы. Энтеропептидаза, образуемая клетками эпителия кишечника, является активатором трипсина: она отщепляет гексапептид и превращает трипсиноген в трипсин.

Ингибиторы тоже бывают:

1. Неспецифическими, т.е. угнетают активность определенной группы ферментов. Угарный газ (окись углерода - СО) и соли синильной кислоты - неспецифические ингибиторы ферментов, содержащих гем.

Ингибиторы могут угнетать ферментативную активность обратимо и необратимо. Ингибиторы, вызывающие необратимое угнетение, называются ферментными ядами. Например, фосфорорганические вещества (ФОБ) необратимо угнетают активность ряда липаз, протеаз и особенно ацетилхолинэстеразы, фосфорилируя каталитическую группу ферментов, в результате ацетилхолин накапливается в синапсах и вызывает отравление организма. Некоторые необратимые ингибиторы образуют ковалентные связи с ферментом, например, нейротоксический эффект некоторых инсектицидов обусловлен необратимым связыванием каталитического участка фермента ацетилхолинэстеразы.

2. Специфические ингибиторы - антиферментные вещества, подавляющие активность одного фермента. К ним относятся полипептиды, которые, присоединяясь к цепи фермента, прикрывают его активный центр или не дают сформироваться активному центру. Примером может служить ингибитор трипсина, при отщеплении которого энтеропептидазой формируется активный центр фермента. К названию фермента, имеющего специфический ингибитор, добавляется суффикс «оген» или приставка «про». Например, трипсиноген и прокарбоксипептидаза - это неактивные формы соответствующих ферментов.

По характеру различают конкурентное, неконкурентное и аллостерическое ингибирование.

Конкурентное ингибирование наблюдается в том случае, когда ингибитор имеет структурное сходство с субстратом, поэтому может связаться с активным центром фермента, образуя фермент-ингибиторный комплекс. При этом ингибитор может занимать не весь активный центр фермента.

Если увеличить концентрацию субстрата, то действие ингибитора снимается. Все конкурентные ингибиторы характеризуются выраженным структурным сходством с соответствующим субстратом, т.е. специфичность фермента недостаточна, чтобы отличить субстрат от ингибитора. Например, янтарная кислота субстрат СДГ, малоновая и щавелевоуксусная являются ингибиторами СДГ, т. к. могут связываться с ее активным центром и прекращать реакцию окисления янтарной кислоты этим ферментом. К конкурентным ингибиторам относятся также антиметаболиты, которые при введении в организм вызывают аномальные явления и тормозят метаболизм. Например, сульфаниламид очень схож по строению с парааминобензойной кислотой, входящей в структуру фолиевой кислоты - кофермента метилтрансфераз. Встраивание его в кофермент ТГФК приводит к потере ферментом активности. На этом основано применение сульфаниламидных препаратов в медицине.

К конкурентному ингибированию относят и ингибирование продуктами реакции. Продукты реакции по структуре часто похожи на субстрат, поэтому, накапливаясь, они ингибируют фермент. Данный вид конкурентного ингибирования имеет значение в регуляции метаболизма.

Глюкоза в данном случае служит ингибитором глюкозо-6-фосфатазы.

При неконкурентном ингибировании конкуренция между субстратом и ингибитором отсутствует, т. к. ингибитор не имеет структурного сходства с субстратом. Поэтому ингибитор не влияет на связывание субстрата с ферментом в его активном центре. Действие ингибитора проявляется в том, что он связывается с каталитическими группами в активном центре или, связываясь вне его, изменяет конформацию активного центра, мешая взаимодействию с ним субстрата. При этом вместо фермент-субстратного комплекса образуется комплекс фермент-субстрат-ингибитор, который не подвергается превращениям. Такими ингибиторами являются цианиды, которые, связавшись с железом, входящим в каталитический центр цитохромов, ингибируют их. Ионы тяжелых металлов оказывают ингибирующее действие, блокируя тиогруппы каталитических центров ферментов.

Аллостерическое активирование и ингибирование ферментов является примером нековалентной регуляции активности ферментов.

Такой вид регуляции активности фермента характерен для ферментов, имеющих четвертичную структуру и аллостерические центры - центры регуляции, располагающиеся недалеко от активного центра. Изменения в этом центре при воздействии на них эффекторов (активаторов или ингибиторов) отражаются на конформации активного центра. Активный центр становится или более соответствующим по форме субстрату (под влиянием активаторов), тогда активность фермента резко повышается, или теряет сродство к субстрату, и наблюдается торможение действия фермента.

Некоторые ферменты имеют несколько аллостерических центров. Одни из них специфичны к ингибиторам, другие - к активаторам. Такие ферменты называются аллостерическими и занимают ключевое положение в метаболизме.

26Современная классификация и номенклатура ферментов.

1) тривиальная номенклатура 2) рабочая номенклатура З) систематическая номенклатура, т.е. обычно для названия одного и того же фермента очень часто используют несколько названий, поэтому в следствии все возрастающего числа вновь открываемых ферментов было принято международное соглашение о систематической номенклатуре ферментов. В соответствии с этой системой все ферменты в зависимости от типа катализируемой реакции, я еще раз подчеркиваю что в основу положен тип катализируемых реакций, делят на 6 больших классов. В каждом классе выделяют подкласс. В подклассе выделяют под подкласс, а уже там соответственно название конкретного фермента. Шифр фермента для того что бы было понятно о каком ферменте говорит китаец если его читает русский. Например 4 буквенное обозначение 1 -ая класс, 1 подкласс, 1 под подкласс и первый порядковый номер в этом под подклассе, т.е. шифр фермента всегда включает 4-ех цифровое обозначение. Какие же классы по международному соглашению 1961 г. выделяют? а). Оксидоредуктазы - ферменты катализирующие окислительно-восстановительные реакции в организме человека б). Трансферазы - ферменты катализирующие реакции с переносом групп между различными веществами. Например переносящие метильную группу - метилтрансферазы, аминогруппу переносящие - аминотрансферазы и т.д. в). Гидролазы - ферменты катализирующие реакции гидролиза (гидролиз - расщепление с присоединением воды Гидролитических ферментов достаточно много. С пищей мы получаем полимеры, для того чтобы они всасывались их нужно расщепить до мономеров. г). Лиазы -1. ферменты катализирующие присоединение групп по двойной связи (имеется ввидупо месту разрыва двойной связи). 2. Разрыв углерод - углеродной связи, водороднымииегидролитическим путем. Например, фермент декарбоксилаза, отщепляющая карбоксильную группу от аминокислоты, как раз относится к лиазам. д). Изомеразы - ферменты катализируют реакции изомеризации. В основном это перенос групп внутри молекул с образованием изомерных форм. Например превращение глюкозы 1- фосфат в глюкозу 6 -фосфат, т.е перенос фосфорильного остатка от первого.е) Лигазы или синтетазы - ферменты которые катализируют образование связи С-С, C-S, C-N, С-О за счет реакции конденсации сопряженных с использованием АТФ, т.е это реакции эндоорганические, требующие притока энергии. В настоящее время идентифицировано более 2000 различ. ферментов, причем 200 из них получены и используются достаточно хорошо в кристаллическом виде. В наше время ферменты используются не только в медицине, но и в пищевой и хим. промышленности, в народном хоз-ве, для получения особо чистых препаратов (лекарств). Ферменты - специализированные белки обладающие каталитической активностью, т.е. способны ускорять течение химической реакции в организме человека. Ферменты, будучи биокатализаторами, отличаются от обычных катализаторов. Каково значение ферментов в организме человека? Ферменты по праву считают рабочим аппаратом ген. Дело в том, что как реализуют этот фермент? Все зависит от того насколько активны у вас ферменты полученные. Не секрет что сидящие здесь имеют одни и те же ферменты, но ферменты работают у каждого индивидуально. У каждого из нас поддерживается 1. Определенная концентрация ферментов. 2. Поддерживается еще и за счет синтеза активность определенных ферментов, поэтому метаболизм наш в целом очень различается.

27Определение количественного содержания ферментов в биологических объектах представляет известные трудности, поскольку, за редким исключением, ферменты в тканях присутствуют в ничтожно малых концентрациях. Поэтому о количестве ферментов судят по скорости катализируемой реакции в определенных, согласованных условиях измерения. При оптимальных условиях температуры, рН среды и полном насыщении фермента субстратом скорость катализируемой реакции пропорциональна концентрации фермента. О скорости ферментативной реакции судят или по скорости убыли субстрата, или по скорости образования продукта реакции. Для выражения концентрации фермента и количественной оценки его активности в условных единицах Комиссией по ферментам Международного биохимического союза была рекомендована стандартная международная единица (Е или U): за единицу активности любого фермента принимается то количество его, которое в оптимальных условиях катализирует превращение 1 микромоля субстрата или образование 1 микромоля продукта в минуту (мкмоль/мин).

В связи с введением Международной системы единиц (СИ) предложено новое выражение активности фермента в каталах (кат, kat): 1 кат есть каталитическая активность, способная осуществлять реакцию со скоростью, равной 1 молю в 1 с (1 моль/с). Отношение международной единицы (U) к каталу можно выразить следующим образом: 1 кат = 1 моль•с–1 = 60 моль•мин–1 = 60•106 мкмоль•мин–1 = 6•107 U, или: 1 U = 1 мкмоль•мин–1 = (1/60) мкмоль•с–1 = (1/60) мккат = 16,67 нкат. Таким образом, 1 U фермента соответствует 16,67 нкат.

Рекомендовано, кроме того, измерять активность фермента при температуре 25°С, оптимуме рН и концентрации субстрата, превышающей концентрацию насыщения. В этих случаях скорость соответствует нулевому порядку реакции в отношении субстрата и будет зависеть только от концентрации фермента.

Для выражения активности в практической работе с ферментами часто пользуются произвольными понятиями удельной и молярной активности. Удельную активность фермента принято выражать числом единиц ферментативной активности на 1 мг белка (или числом каталов на 1 кг активного белка). Количество молекул субстрата, подвергающихся превращению одной молекулой фермента в продукт в процессе реакции в единицу времени при полном насыщении фермента субстратом, принято называть числом оборотов фермента, или молярной активностью (молярная каталитическая активность выражается в каталах на 1 г-моль фермента). Одна молекула каталазы эритроцитов способна, например, расщепить в 1 с 44000 молекул перекиси водорода.