Днк ферментативным методом

Полученные фрагменты ДНК разделяют в полиакриламидном геле с точностью до нуклеотида. Затем проводят радиоавтографию и по картине распределения фрагментов в четырёх пробах устанавливают нуклеотидную последовательность ДНК (рис. 8.22б).

Располагая такой информацией, можно локализовать на ДНК биологически важные участки. Так, например, показано, что репликация вируса SV 40 всегда начинается в одном специфическом фрагменте и продолжается в обоих направлениях. Рестрикционные карты и рестрикционные фрагменты были также использованы для картирования участков ДНК, на которых синтезируются м-РНК для вирусных белков.

В настоящее время расшифрованы последовательности большинства прокариотических организмов. Из эукариот полностью секвенированы геномы дрожжей, риса, нематоды, дрозофилы, мыши, человека и др. Существует огромное количество компьютерных программ, позволяющих проводить компьютерный анализ полученных секвенированных последовательностей, в том числе в сравнении с уже известными последовательностями.

Сразу вслед за разработкой быстрых методов секвенирования появились столь же быстрые и простые методы синтеза сравнительно длинных олигонуклеотидов с определённой, заранее заданной последовательностью. Теперь довольно легко можно синтезировать последовательность до 100 нуклеотидов. Автоматизация этой процедуры значительно облегчает и ускоряет синтез.

8. 9. Амплификация (увеличение числа копий) фрагментов днк с помощью метода полимеразной цепной реакции (пцр)

Методы исследования наследственного материала (нуклеиновых кислот) постоянно совершенствуются, при этом для анализа структуры ДНК требуется определённое количество клеточного материала. Например, даже при использовании такого высокочувствительного метода, как фиргерпринт ДНК т. е. высокоспецифичных гибридизационных полос на электрофореграммах, образующиеся как результат полиморфизма длины рестрикционных фрагментов геномной ДНК, требовалось наличие капли крови или другого эквивалентного количества образца животной или растительной ткани, содержащих в клетках достаточное для анализа количество копий ДНК.

Сегодня ситуация радикально изменилась благодаря появлению метода, который был разработан Кэри Мюллисом. Этот метод получил название полимеразной цепной реакции (ПЦР) и стал неотъемлемой процедурой, освоенной во всех генно-инженерных лабораториях мира. Использование методики ПЦР позволяет амплифицировать (размножать) ДНК или её фрагмент in vitro, увеличивая количество копий в миллионы раз за несколько часов.

ПЦР осуществляют в пробирке с помощью специального термостабильного фермента ДНК-полимераза (Tag-полимераза), набора всех четырёх нуклеотидов А, Т, Г и Ц и коротких олигонуклеотидных затравок – праймеров. Праймеры – это короткие, длиной в 20-30 нуклеотидов, одноцепочные фрагменты ДНК, комплементарные 3’-концевым последовательностям копируемой ДНК-матрицы. Благодаря праймерам ограничивается фрагмент ДНК, который будет скопирован Tag-ДНК-полимеразой, присоединяющейся к 3’- концам праймеров и достраивающей их до заданной длины. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) протекает в три стадии (рис. 8.23).

Рис. 8.23. Последовательность стадий размножения