Идентификации днк методом Саузерн-блот гибридизации
3.Мембрана помещается в гибридизационный буфер, содержащий специальный радиактивно меченый ДНКовый зонд. Зонд способен гибридизоваться с определённым комплементарным фрагментом ДНК и свяжется только с одной или несколькими конкретными фракциями из всего электорофоретического спектра полученных рестрикционных фрагментов ДНК.
4.К нитроцеллюлозной мембране, содержащей весь спектр полученных фрагментов ДНК, включая фракции, гибридизовавшиеся с радиоактивно меченым зондом, прикладывают рентгеновскую плёнку. На плёнке (авторадиограмме) после экспозиции выявляются засвеченные места, соответствующие расположению меченых фракций ДНК. Этот метод получил название Саузерн - блот гибридизации в честь разработавшего его Эдварда Саузерна.
К настоящему времени удалось практически полностью расшифровать (прочитать) абсолютное большинство генов даже у таких сложных видов, как человек и дрозофила. Для этих и многих других видов получено огромное количество различных ДНКовых зондов (проб), которые успешно используются в Саузерн-блот анализе.
8. 8. Секвенирование днк и получение генов
В условиях практического использования генетической инженерии важно быстро секвенировать (т.е. определить последовательность нуклеотидов) любые фрагменты ДНК. При существующем огромном объёме информации о последовательностях ДНК, для анализа данных о геномах необходимы новые технологии и компьютерная техника.
В биотехнологии рекомбинантных ДНК обычно используют два различных метода секвенирования ДНК:
- химический;
- ферментотивный.
Оба метода чрезвычайно надёжны, быстры в исполнении и результативны. Результаты секвенирования позволяют на основе генетического кода определить аминокислотную последовательность белка в соответствии с нуклеотидной последовательностью в соответствующем гене. На рис. 8.20 представлена схема химического метода секвенирования ДНК.
Рис. 8.20. Схема получения
Семейства меченных фрагментов днк
Исходный фрагмент ДНК, меченный 32Р по 5’- концу, подвергается специфическому расщеплению по определённому нуклеотиду (например, А), в результате чего образуются фрагменты разной длины, которые разделяются по размерам при гель-электрофорезе.
Обычно химическая процедура расщепления ДНК выполняется одновременно для четырёх одинаковых проб ДНК с использованием химических реагентов, расщепляющих ДНК по отдельным нуклеотидам (Т, С, G и А). Полученные образцы подвергают электрофорезу на параллельных дорожках одного геля и по его результатам определяют нуклеотидную последовательность ДНК (рис. 8.21).
Рис. 8.21. Схема электрофореграммы,
Полученной методом секвенирования днк
Широко сегодня применяется также и метод ферментативного секвенирования путём терминации (остановки синтеза) цепи (рис. 8.22а). В основе метода лежит принцип репликации комплементарной цепи ДНК на одноцепочной матрице при происходящем в различных местах ДНК обрыве синтеза, т. е. детерминации роста цепи.
Поскольку в основе секвенирования лежит процесс репликации ДНК, то основным ферментом является ДНК-полимераза. В присутствии одноцепочной ДНК-матрицы, короткого полинуклеотидного праймера и нуклеотидов по принципу комплементарности будет происходить синтез второй цепи ДНК. При этом удлинение цепи будет происходить до тех пор, пока вместо дезоксинуклеотида не присоединится дидезоксинуклеотид. Присоединение последнего приведёт к остановке синтеза.
Рис. 8.22. Определение нуклеотидной последовательности