В качестве объекта для клонирования и экспрессии

8.7. Метод электрофорезного разделения днк и этапы идентификации днк по Саузерну

Используя специальные наборы ферментов рестрикции исследователи научились получать фрагменты ДНК разных размеров практически из любых видов. В ходе манипуляций с различными фрагментами ДНК часто необходимо определить размер или выделить конкретный участок ДНК из смеси.

Сегодня уже выяснено, что фрагменты ДНК легче всего разделять с помощью метода электрофореза в агаровом геле. ДНК, обработанную одной или несколькими рестриктазами, помещают на пластину, в лунки застывшего агарового геля (рис. 8.18), которая помещается затем в специальную камеру для электрофореза. В камере создаётся электрическое поле, под действием которого фрагменты ДНК начинают перемещаться в пористом, похожем на мармелад геле. Скорость продвижения фрагментов ДНК в геле зависит от их длины. Короткие фрагменты движутся быстрее, чем длинные, что позволяет цепочкам ДНК разной длины отделиться друг от друга. При этом фрагменты ДНК не повреждаются и их можно выделить из геля без всяких повреждений и потери биологических свойств.

Рис. 8.18. Схематическое изображение пластины с лунками,

Для электрофореза днк в агаровом геле

Установлено, что если после электрофореза окрасить гель красителем этидиум бромидом, связывающимся с ДНК, и поместить гель под ультрафиолетовый свет, то на нём будут хорошо видны окрашенные в красный цвет, расположенные на различном расстоянии друг от друга светящиеся фракции ДНК. Каждая такая фракция соответствует одному фрагменту ДНК. При этом, разные рестриктазы дают разную картину расщепления одной и той же ДНК (электрофоторгамма на рис. 8. 18., справа).

В результате, электрофорез в агаровом геле позволяет разделить, а затем легко извлечь любые рестрикционные фрагменты ДНК в чистом виде, для последующего использования. Кроме этого, анализируя электрофорезные спектры ДНК на геле, наблюдая за исчезновением одних и появлением других фракций под действием разных рестриктаз, в практических условиях уже составляют генетические рестрикционные карты расположения участков ДНК. Первую полную физическую карту расположения участков 14 рестриктаз составил Д. Натанс для ДНК вируса sv- 40.

В 1975 году был разработан метод, который позволяет идентифицировать конкретные гены и другие рестрикционные фрагменты ДНК после их электрофорезного разделения. Метод включает следующие этапы: 1.Фрагменты ДНК, разделённые в агаровом геле, денатурируются до одноцепочных молекул;2.Весь электрофорезный спектр ДНК отпечатывается за счёт капиллярных сил на приложенной к гелю нитроцеллюлозной мембранной плёнке. После этого фиксируется при помощи высокой температуры (рис. 8.19).

1 2

3

4

Рис. 8.19. Схематическое изображение основных этапов