9. 2. 1. Методы введения чужеродного гена в организм животного

Микроинъекция раствора ДНК.

Получение трансгенных животных путём микроинъекции гена включает следующие этапы:

1. Гормональную индукцию охоты и полиовуляции по имеющейся для каждого вида животных схеме;

2. Осеменение;

3. Извлечение оплодотворённых яйцеклеток посредством промывания яйцеводов, полученных от забитых на мясокомбинате животных-доноров.

4. Проведение микроинъекции в зиготу. Для этого необходимо осуществление следующих мероприятий:

-на максимально устойчивый рабочий стол устанавливают микроскоп, два микроманипулятора для управления удерживающей и инъекционной пипетками и прибор для регулирования инъекционного давления;

- на столике микроскопа устанавливают инъекционную камеру со средой, покрытой парафиновым маслом;

- в среду помещают зиготы;

-для инъекции зиготы фиксируют на удерживающей пипетке так, чтобы инъецируемый пронуклеус был хорошо виден;

- кончик инъекционной пипетки (внутренний диаметр не более 1 мкм) наполняют раствором ДНК;

- для инъекции пипетку через прозрачную оболочку и клеточную мембрану вводят в пронуклеус (ядро), после чего в него инъецируют 1-2 пкл раствора ДНК.

- о точности операции судят по набуханию пронуклеуса. Только такое визуальное увеличение объёма ядра свидетельствует о том, что раствор ДНК был действительно введён в пронуклеус;

-после инъекции эмбрионы освобождают от удерживающей пипетки и культивируют до момента пересадки реципиентам.

5. Пересадка реципиентам. Коровам и кобылам – реципиентам пересаживают по 2 эмбриона (по 1 в каждый рог матки) на 7 день культивирования в стадиях поздней морулы или ранней бластоцисты. Каждому реципиенту мыши, кролика и свиньи пересаживают 20-30 инъецированных зигот, причём у свиней все они трансплантируются в один яйцевод, а у мышей и кроликов – раздельно по яйцеводам. У овец и коз каждому реципиенту пересаживают по три - четыре эмбриона.

6. Животных, родившихся из инъецированных эмбрионов, индивидуально метят, берут у них пробу крови для доказательства интеграции ДНК. Интеграцию ДНК проверяют дот-блот-гибридизацией по Саузерну.

Пересадка гена в ооциты путём введения его в сперму.

После большого числа исследований и фундаментального изучения механизма переноса гена через спермии разработан простой и эффективный метод переноса трансгена в ооциты путём использования спермиев. С. Spadafora с сотр. (1998) первыми разработали и запатентовали основные положения, которые позволяют объяснить механизм, как может быть осуществлена пересадка гена через спермии. Такая пересадка в настоящее время уже осуществлена на таких видах животных и птицы, как крупный рогатый скот, куры (М. Shenesh et al.2000), а также свиньи (F. Carello et al. 2002).

Учёные в Израиле (М. Spemesh et al., 2004) использовали пересадку гена при помощи спермиев для получения трансгенного крупного рогатого скота и кур. Эффективность интеграции у крупного рогатого скота достигла 100% (у 4 из 4 родившихся телят) и подобная результативность у кур (17 из 19 цыплят). Эти первые результаты исследований хотя и весьма обнадёживающие, но требуют дополнительного подтверждения путём более массовых и масштабных исследований.

Пересадка генетически трансформированных клеток

в энуклеированные яйцеклетки.

В отличие от микроинъекции генов в пронуклеус зиготы этим методом ген вводят в соматические клетки путём обычной трансфекции (т.е. искусственной интеграции чужеродной очищенной ДНК в геном культивируемых клеток животных и человека путём прямого переноса). В этой технологии в качестве соматических клеток используют фетальные фибробласты (эмбриональные зародышевые клетки, отслаивающиеся от плода и находящиеся в амниотической жидкости в виде суспензии), генетически модифицированные разными методами. Их подсаживают к энуклеированным ооцитам и соединяют с цитоплазмой, как правило, электрослиянием.

Реконструированные ооциты, вступившие в стадию эмбрионального развития, трансплантируют животным-реципи-ентам. Таким образом, осуществляется клонирование животных путём пересадки не обычной, а генетически трансформированной соматической клетки в энуклеированную яйцеклетку.

Трансгенные овцы, продуцирующие с молоком человеческий «фактор 9» для лечения гемофилии, впервые были получены Schnike A. et al. (1997) путём пересадки соматических ядер в энуклеированные яйцеклетки. Аналогичным методом были получены трансгенные козы (Keefer С. et al., 2001).

С использованием метода клонирования в опытах I. Gibelli et al. (1998) пересадка 9 реконструированных эмбрионов коровам-реципиентам сопровождалась получением одного трансгенного телёнка, тогда как по сообщению Wall W. et al. (1992) для получения аналогичного результата было пересажено 50 эмбрионов. На фирме «Инфиноген» (США) на получение одного трансгенного телёнка, продуцирующего с молоком человеческий сывороточный альбумин, было использовано 19 клонированных эмбрионов.

Таким образом, использование метода клонирования эмбрионов для получения трансгенных животных существенно сокращает время и стоимость получения трансгенных животных.

Этот приём позволяет получать только самок уже в первом поколении, так как существующие генетические методы позволяют отобрать только плоды самок для получения фетальных фибробластов. В результате не требуется дополнительное время на процесс разведения исходных лактирующих трансгенных животных.

С использованием метода пересадки ядер стадо, например, из 10 трансгенных коров, достаточно для обеспечения потребности фармацевтического рынка в лекарственном препарате. Оно может быть создано уже в первом поколении, тогда как при инъекции гена потребовалось бы получение как минимум двух и более поколений, чтобы получить продуктивное стадо. Это позволяет сэкономить два года для создания каждого поколения.