При синтезе интерферона человека в e. Coli.
Установлено, что интерфероны синтезируются в клетке сначала в виде предшественников, содержащих на N-конце полипептидной цепи сигнальный пептид, который затем отщепляется и, в результате, образуется зрелый интерферон, обладающий полной биологической активностью. Бактерии не содержат ферментов, способных отщепить сигнальный пептид с образованием зрелого белка. Для того чтобы бактерии синтезировали зрелый интерферон, следует ввести в плазмиду только ту часть гена, которая его кодирует, и удалить часть гена, кодирующую сигнальный пептид. Процедура требует соблюдения следующих условий:
- Ген интерферона должен содержать три участка расщепления рестриктазой Sau 3A1, из которых один находится рядом с сигнальной частью.
- Неполное расщепление гена этим ферментом позволяет выделить фрагмент гена, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелый интерферон.
- Триплет ATG, кодирующий цистеин, отщепляется ферментом вместе с сигнальной частью.
-Для восстановления полинуклеотидной последовательности полного гена химически был синтезирован фрагмент ДНК, содержащий этот триплет, а также примыкающий к нему триплет ATG-точка инициации синтеза белка.
- Этот фрагмент присоединили к изолированной части зрелого гена, в результате был восстановлен полный ген зрелого интерферона.
- Реконструированный ген ввели в плазмиду таким образом, что с ним оказался рядом участок ДНК-промотор, обеспечивающий начало синтеза мРНК.
- Экстракты из E. Coli, содержащие такую плазмиду, обладали противовирусной активностью.
Синтезированный генно-инженерным способом интерферон был выделен, очищен, и его физико-химические свойства оказались близкими свойствам интерферона, полученного из крови доноров. Удалось получить бактерии, способные синтезировать до 5 мг интерферона на 1 л бактериальной суспензии, содержащей примерно 1011 бактериальных клеток, что в 5000 раз превосходит то количество интерферона, которое можно извлечь из 1 литра крови доноров.
В настоящее время гены интерферонов клонированы в дрожжи и клетки высших эукариот, способных осуществлять гликолизирование.
В 1991 году в США впервые для синтеза лейкоцитарного интерферона человека были употреблены генетически сконструированные клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Полученная эффективная экспрессия гена LeIF и замена бактерий клетками дрожжей позволили увеличить производство интерферона в 10 раз.
В России в 1994 году был осуществлён полный синтез гена α-И размером примерно 600 н. п. (нуклеотидных пунктов) в Институте биоорганической химии под руководством Н. М. Колосова.
Несмотря на успехи, достигнутые в области получения интерферонов с помощью генно-инженерных технологий и их применения для лечения различных вирусных заболеваний, в том числе онкологических, предстоит решить ещё многие вопросы, касающиеся расшифровки механизмов их биосинтеза и взаимодействия с другими веществами.
Схема биологического действия интерферона представлена на рисунке 8.34.
Рис. 8.34. Механизм действия интерферона
Механизм действия интерферона можно свести к следующим основным этапам:
1. Связываясь с клеточными рецепторами, интерфероны инициируют синтез ферментов 5'-олигоаденилансинтетазы и протеинкиназы за счёт инициации транскрипции соответствующих генов;
2. Оба фермента проявляют свою активность в присутствии двухцепочных ДНК, являющихся продуктами репликации многих вирусов;
3. Фермент 5'-олигоаденилансинтетаза катализирует синтез 2' 5'-олигоаденилатов (из АТР), которые активируют клеточную рибонуклеазу;
4. Протеинкиназа фосфорилирует и тем самым активирует фактор инициации трансляции IF2. В результате этих событий ингибируется биосинтез белка и размножение вируса (деградация иРНК и рРНК) в инфицированной клетке, что вызывает её лизис.