Серотипаж вирусов

В серотипаже вирусов используют многие серологичес­кие реакции: РИФ, ИФА, РИА, иммуноферритиновую, РСК, РПГ, РНГП, но чаще всего реакцию нейтрализации (РН) вирусов, реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) и реакцию торможения гемадсорбции (РТГадс), являющихся модификациями РН.

РН и ее модификации. РН вирусов воспроизводится в трех вариантах: на культурах клеток; куриных эмбрио­нах; животных (рис. 114). В любом из них при ее поста­новке взвеси инфицированных вирусом клеток, жидкос­тей различных полостей куриного эмбриона или суспен­зий пораженных тканей животных смешивают с различ­ными разведениями диагностической противовирусной сыворотки или, наоборот, разные разведения вируса до­бавляют к цельной неразведенной иммунной сыворотке. Смеси инкубируют в термостате в течение 1-2 ч при тем­пературе 37 °С или помещают в холодильник на 18 ч при

температуре 4 °С, и вслед за этим заражают монослой кле­ток, куриные эмбрионы и животных. О нейтрализующей силе противовирусных антител на клеточном пласте судят по его нормальному развитию в течение 10-15 сут, а на ку­риных эмбрионах и животных - по выживанию и отсут­ствию изменений на ХАО (2-3 сут) и в тканях животных (5-7 сут).

В тех случаях, когда идентифицируются вирусы, вы­зывающие обширную деструкцию клеточного пласта, РН ставят под агаровым покрытием. Для этого из флакона с монослойной культурой клеток удаляют питательную среду и заражают ее взвесью вируса. Через 30-60 мин пос­ле адсорбции вируса на клетках монослой покрывают 3 %-ным расплавленным агаром, содержащим лошади­ную сыворотку, солевые добавки и как индикатор - ней­тральный красный. Зараженную вирусом культуру кле­ток помещают в термостат. В контрольных флаконах при нормальном росте клеток в результате выделения ими ме­таболитов происходит подкисление среды и монослой рав­номерно окрашивается индикатором в розовый цвет. В опытных флаконах монослой пестрит — розовые участки клеток, не пораженные вирусами, перемежаются с мелки­ми беловатыми островками-бляшками различной конфи­гурации, специфичными для того или иного вируса.

Идентификация вирусов по их цитопатическому и па­тогенному действию в РН требует длительного времени, немалых усилий и умения. Гораздо легче видовую при­надлежность вирусов установить в РТГА или РТГадс, представляющих собой РН антисыворотками вирусных гемагглютининов.

РТГА. Большинство вирусов обладают способностью агглютинировать определенные эритроциты. Так, вирусы гриппа и эпидемического паротита агглютинируют эрит­роциты кур, морских свинок, человека; вирус клещевого энцефалита - эритроциты барана; вирусы японского энце­фалита - эритроциты однодневных цыплят и гусей; адено­вирусы - эритроциты крыс, мышей, обезьян. В связи с этим для их обнаружения в материале больных или куль­турах клеток, эмбрионов и животных ставят реакцию ге­магглютинации (РГА). Для этого в лунках плексигласо­вых планшет готовят двукратно возрастающие разведе­ния вируссодержащих жидкостей в объеме 0,5 мл, добавляя к ним по 0,25 мл 2 %-ной взвеси эритроцитов, триж­ды отмытых изотоническим раствором натрия хлорида. Для контроля спонтанной агглютинации 0,5 мл эритроци­тов смешивают с равным объемом изотонического раствора натрия хлорида. Смеси инкубируют в термостате при тем­пературе 37 °С или в холодильнике при 4 °С, но можно оста­вить при комнатной температуре. Результаты РГА учиты­вают по характеру агглютинации эритроцитов через 30-60 мин, когда они полностью осаждаются в центре конт­рольной лунки, образуя плотный осадок в виде «пугови­цы». Положительная реакция обозначается плюсами: «++++» - звездчатой формы осадок с фестончатыми края­ми в виде «зонтика», покрывающего всю лунку; «+++» -осадок с просветами; «++» - осадок с большими просвета­ми; «+» - хлопьевидный осадок, окруженный зоной ском-кованных эритроцитов; «—» - такой же резко очерченный осадок эритроцитов, как и в контроле. При помощи РГА оп­ределяют также титр вируса или наибольшее его разведение, при котором еще наблюдается агглютинация эритроцитов, что соответствует одной гемагглютинирующей единице.

Являясь группоспецифической, РГА не дает возмож­ности определить видовую принадлежность вирусов. Их идентифицируют с помощью РТГА. Для ее постановки ис­пользуют диагностические противовирусные сыворотки, которые в двукратно снижающихся концентрациях разво­дят в изотоническом растворе натрия хлорида и разливают по 0,25 мл. К каждому их разведению добавляют равное количество вируссодержащей жидкости, при типировании вируса гриппа, например, в четырехкратном титре (т. е. 4 гемагглютинирующие единицы). Контролем является взвесь вируса в изотоническом растворе натрия хлорида. Планшеты со смесью сывороток и вируса выдерживают в термостате 30 мин или при комнатной температуре 2 ч, за­тем в каждую из них добавляют по 0,5 мл 1 % -ной взвеси эритроцитов. Спустя 30-45 мин определяют титр вирус-нейтрализующей сыворотки, т. е. максимальное ее разве­дение, вызвавшее задержку агглютинации эритроцитов.

РТГадс. По своей сути РТГадс является аналогом РТГА. Производится она на двух зараженных вирусами монослойных культурах клеток, одна из которых предва­рительно обрабатывается диагностической сывороткой, нейтрализующей вирусные гемагглютинины. В тот и дру­гой монослой при ее постановке вводят 0,2 мл 0,4 %-ной взвеси отмытых изотоническим раствором натрия хлори­да стерильных эритроцитов, чувствительных к гемагглю-тинирующему действию предполагаемого вируса. Про­бирки ставят в наклонном положении на 30 мин в термо­стат при температуре 37 °С (или оставляют при комнатной температуре), затем помещают во вращающийся барабан для удаления неадсорбированных эритроцитов. Учитыва­ют РТГадс, используя малое увеличение микроскопа. Ее считают положительной, если в опытном монослое, обра­ботанном антисывороткой, отсутствует реакция гемадсорб-ции, а на интактном - отмечается диффузная или локаль­ная реакция адсорбции эритроцитов в виде небольших скоплений, гроздей и розеток.