Лекция № 8

Тема:

«Вирусы. Морфология и физиология вирусов.

РНК- и ДНК-содержащие вирусы. ВИЧ и СПИД».

Вопросы:

Морфология вирусов. Особенности репродукции вирусов. Профилактика вирусных заболеваний, особенности терапии. Основные методы диагностики вирусных инфекций.

РНК-содержащие вирусы. Вирусы гриппа. Эпидемиология и патогенез гриппа. Иммунитет. Специфическая профилактика.

ДНК-содержащие вирусы. Вирусы гепатитов. Эпидемиология и патогенез. Иммунитет. Специфическая профилактика.

ВИЧ. СПИД. Актуальность вопроса. Эпидемиология и патогенез заболевания. Профилактика.

Лабораторная диагностика вирусных инфекций человека и животных

Лабораторная диагностика вирусных инфекций чело­века и животных основана: 1) на прямых микроскопичес­ких методах обнаружения вирионов в патологических материалах; 2) серотипаже (идентификации) чистых культур вирусов, выделенных из них; 3) серодиагности­ке, т. е. косвенном способе определения вирусспецифичес-ких антител в сыворотке крови. При этом: материалы ис­следуются в иммерсионном, люминесцентном и электрон­ном микроскопах; культуры вирусов получают, инфици­руя материалами чувствительные к ним линии клеток, куриные эмбрионы и животных; идентификацию вирусов и определение вирусспецифических антител осуществля­ют в серологических реакциях.

Патологические материалы и их обработка. Матери­алами, в которых содержатся вирусы, могут являться: кал, моча, мокрота, носоглоточные смывы, содержимое высыпаний на коже и слизистых оболочках и прочие экскреты; кровь, спинномозговая жидкость, пунктаты плевральной и брюшной полости, суставов, увеличенных лимфатических узлов и другие секреты. От умерших лю­дей и погибших животных берут пораженные вирусами органы и ткани. Здесь нужно отметить, что взятые для исследования материалы при необходимости подвергаются специальной обработке для приготовления мазков и гис­тологических препаратов, а при инфицировании культур клеток, эмбрионов и животных - измельчаются, отстаива­ются, фильтруются, осветляются, концентрируются и обрабатываются антибиотиками, которые уничтожают пос­тороннюю (банальную) микрофлору, в большом количест­ве находящуюся в экскретах.

М икроскопические способы обнаружения вирусов

Рис. 10 9. Схематическое изображение

вирусных включений: 1 - тельца Гуарниери в клетке, зараженной вирусом оспы; 2 - включения в цилиндри­ческом эпителии, зараженном вирусом гриппа; 3 — включения в эпителии, зара­женном реовирусом; 4 — тельца Бабеша — Негри в нейроцитах; 5,6- внутриядерные включения в эпителии, зараженном герпес-и аденовирусом; 7 - внутриядерные и цитоплазматические включения в эпителии, зараженном вирусом кори

Используются два микроскопических способа выявления вирусов в материалах - вирусоскопия в иммерсионном и лю­минесцентном микроскопах и электронная микроскопия.

Вирусоскопия. В иммерсионном световом микроскопе обнаруживаются самые крупные элементарные тельца. Так, при натуральной оспе в жидкости кожных пузырь­ков находят внеклеточные вирионы Пашена, а в таких же везикулах при ветряной оспе - вирионы Арагао.

Легче при вирусных инфекциях обнаружить внутри­клеточные включения. В большинстве своем они представ­лены скоплениями вирусов вперемежку с реактивными клеточными продуктами и в зависимости от места репликации вирионов находятся в цитоплазме или ядре клеток-хозяев. В частности, цитоплазматическими включениями являются тельца Гуарниери в эпителиальных клетках, скопления реовирусов и вирусов гриппа в них, тельца Ба­беша - Негри - в нейроцитах, а ядерными включениями -адено-, папова- и герпесвирусные, правда, состоящие из клеточного материала. Изредка в одной и той же клетке вирусы, например коревой, формируют цитоплазматические и ядерные включения (рис. 109).

По форме, размерам, структуре, отношению к краси­телям все эти и другие вирусные включения строго спе­цифичны. Например, тельца Гуарниери имеют округлую, серповидную или амебоидную форму с диаметром 1-10 мкм, тельца Бабеша - Негри - овальные или эллипсоидные, достигающие 20 мкм, включения реовирусов - серпо­видные, наполовину охватывающие клеточное ядро, коревые включения - в виде почкующихся мелких дрожжей.

При этом для обнаружения телец Пашена и Арагао мазки подвергают «серебрению» по методу Морозова или обрабатывают вируснейтрализующими антителами, ме­ченными флюорохромами.

Проводя «серебрение», заранее готовят три раствора: № 1 - уксус-но-формалиновый фиксатор (100 мл дистиллированной воды + 1 мл ледяной уксусной кислоты + 2 мл 40 % -ного формалина); № 2 - та­нин-феноловая протрава (10 мл той же воды + 5 г танина + 1 мл жидкого фенола); № 3 - адсорбент (свежеприготовленный 5 % -ный раст­вор нитрата серебра с добавлением нескольких капель аммиака, вы­зывающего легкую опалесценцию). «Серебрение» мазков выполняет­ся в три этапа с промыванием после каждого из них водопроводной во­дой: мазки фиксируются раствором № 1 в течение 1 мин; протравлива­ются раствором № 2 с подогревом до отхождения паров; «серебрятся» раствором № 3 с подогревом до появления темно-коричневого цвета.

В высушенных мазках под иммерсионным микроско­пом обнаруживают грозди кокковидных вирионов корич­нево-черного цвета.

В препаратах, обработанных мечеными антителами (см. «Реакцию иммунофлюоресценции»), при люминесцент­ной микроскопии обнаруживают вне- и внутриклеточно расположенные вирионы в виде светящихся точек и конг­ломератов.

Внутриклеточные вирусные включения окрашивают по Туревичу, Муромцеву и Романовскому — Гимзе.

Способ окраски телец Бабеша - Негри и Гуарниери по Туревичу. Пре­параты из срезов гиппокампа при бешенстве или роговицы зараженного кролика при оспе в течение 2 мин окрашивают вначале железным гема­токсилином, вслед за чем промывают водой. Докрашивают 1 % -ным вод­ным раствором кислого фуксина 1 мин и снова промывают водой. На последнем этапе препараты обрабатывают смесью из равных частей на­сыщенного водного раствора пикриновой кислоты и 95 % -ного спирта, быстро промывают, высушивают и на несколько секунд погружают в аб­солютный спирт, вновь высушивают и микроскопируют.

Способ окраски телец Бабеша - Негри по Муромцеву. Из растер­тых в ступке кусочков гиппокампа делают обычные мазки. Фикси­руют их метиловым спиртом или ацетоном в течение 1-2 ч, промы­вают водой; затем 5-10 мин окрашивают разведенным 1 : 50 красителем Мансона (2 г метиленового синего, 5 г буры и 100 мл дистил­лированной воды), после чего переносят в 10 %-ный раствор танина до получения бледно-голубой окраски, промывают водой, высуши­вают; несколько секунд обрабатывают абсолютным спиртом, высу­шивают и микроскопируют.

Окраска мазков по Романовскому - Гимзе осуществляется смесью азур-эозин-метиленового синего после их фиксации в метиловом (5 мин), этиловом (10-15 мин) спиртах или в смеси Никифорова (10-15 мин). Окрашивание длится от 20-30 мин до 1 ч.

Тельца Бабеша - Негри по Туревичу окрашиваются в вишнево-красный цвет с черными зернами внутри, а цито­плазма нервных клеток, в которых они находятся - в свет­ло-желтый; по Муромцеву - в бледно-фиолетовый, а цито­плазма клеток - в синий. Тельца Гуарниери, окрашенные по Туревичу, приобретают темно-синий цвет и тоже хорошо контрастируют в более светлой цитоплазме эпителия.

По Романовскому - Гимзе ядра клеток окрашиваются в пурпурно-красный цвет, цитоплазма - в синий, а вирус­ные включения - в разные цвета и оттенки: тельца Бабе­ша - Негри, в частности, - в красный, включения вируса гриппа - в сине-фиолетовый, тельца Гуарниери - в пур­пурно-красный, а реовирусов - в фиолетовый.

Электронная микроскопия. В электронном микроскопе вирусы идентифицируют по тонким деталям их ультра­структуры. С этой целью получают микрофотографии. Для этого материал, содержащий вирусы, наносят на электрон­но-микроскопические сеточки, покрытые перлодиевой пленкой, и вирионы контрастируют 1 %-ным уранилацетатом или фосфорно-вольфрамовым натрием. Покрывая вирусы, эти вещества создают вокруг них темный фон, а проникая вглубь между компонентами вирионов, способ­ствуют выявлению деталей их структуры. Наконец, кон­фигурация вирионов отчетливо отпечатывается на матри­цах-репликах высохших пленок пластмассы, раствором которых они заливаются. Симметрию и распределение белковых субъединиц в блоке-ансамбле вирусных крис­таллов изучают с помощью рентгеноструктурного анализа.