Реакция иммунофлюоресценции

Имеются два варианта постановки (РИФ): прямая и непрямая (рис. 32). Прямая РИФ – простая реакция, но для ее постановки требуется большое количество меченых антимикробных сывороток. Непрямая РИФ – более сложная реакция, но поставить ее можно имея только одну меченую сыворотку. При этом антиген вначале обрабатывают обычной иммунной специфической сывороткой, а затем к иммунному комплексу антиген–антитело прибавляют меченную флюоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) антисыворотку к антителу этого комплекса. Обычно индикация антигена (микроба) на первом этапе проводится иммунной кроличьей сывороткой, тогда на втором этапе используется меченная ФИТЦ антикроличья сы­воротка, полученная путем иммунизации гамма–глобулинами кроликов, ослов или других животных.

Постановка прямой РИФ: на обезжиренном предметном стекле из исследуемого материала делают тонкие мазки, а из органов и тканей – мазки–отпечатки. Их подсушивают, фиксируют, наносят на мазки взятую в рабочем разведении люминесцирующую сыворотку и помещают во влаж­ную камеру при температуре 37 °С на 20–30 мин. Затем, чтобы удалить избыток флюоресцирующих антител, их промывают (10–15 мин) в забуференном изотоническом растворе натрия хлорида с последующим опо­ласкиванием (10 мин) в дистиллированной или проточной воде. Сушат препараты при комнатной температуре. Исследуют в люминесцентном микроскопе с использованием иммерсионного объектива. Интенсивность флюоресценции в виде зеленого ободка вокруг бактерий оценивают по четырехбалльной шкале: «++++» – очень яркая; «+++» – яркая; «++» –выраженная ободочная флюоресценция; «+» – слабое свечение клеток.

Рис 32. Реакция иммунофлюоресценции.

а – прямая, 6 – непрямая

РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ВИРУСОВ

Рис 33 Реакция нейтрализации вирусов: а– на культуре клеток, б– на курином эмбрионе, в– в организме животных

Идентифицировать вирус по характеру его действия на монослой культуры клеток, которые он разрушает или вызывает в них разного рода структурные изменения, очень трудно, и поэтому прибегают к пос­тановке реакции нейтрализации (РН) вирусов заведомо известными вируснейтрализующими сыворотками. С этой целью полученный от боль­ного вирус накапливают в культуре клеток и различные его разведения смешивают с неразведенной противовирусной сывороткой или, наоборот, постоянную дозу вируса добавляют к различным разведениям иммунной сыворотки. Смеси инкубируют в термостате при температуре 37 °С в течение 1–2 ч. После этого смесями вируса и сыворотки заражают культуру клеток и о нейтрализующей силе ее антител судят по отсутствию цитопатического действия на клетки Смесью вирусов и сывороток можно заражать куриные эмбрионы или чувствительных животных. В таких случаях нейтрализующую активность антител определяют по предотвра­щению развития патологических изменений на хорионаллантоисной обо­лочке; нейтрализации вирусных гемагглютининов в жидкостях эмбриона, устранению летального действия вируса на животных

Подобным образом с помощью РН идентифицируются вирусы, выде­ленные из материала больных при заражении им куриных эмбрионов и животных В таких случаях к вируснейтрализующим сывороткам при­бавляют вируссодержащие жид­кости эмбрионов и взвеси поражен­ных органов животных После оп­ределенного времени инкубации смесями инфицируют культуры клеток, куриные эмбрионы и жи­вотных (рис 33).

В серодиагностике вирусных инфекций РН определяют вирус–нейтрализующие антитела в сыво­ротке больных по известному ви­русу. Ставят ее в динамике с пар­ными сыворотками, одну из кото­рых берут в разгаре заболевания, а вторую – спустя 2–3 недели, и по четырехкратному нарастанию титра антител в этой последней подтверждают диагноз.