Серологические реакции иммунитета

Серологическими называют такие реакции, для постановки которых используют сыворотку (serum), содержащую антитела.

Серологические реакции применяют: а) для идентификации микроор­ганизмов, токсинов, любого другого антигена с помощью известного ан­титела (иммунная диагностическая сыворотка); б) для определения при­роды антитела в сыворотке крови с помощью известного антигена (диагностикум).

Основными серологическими реакциями являются реакции агглюти­нации, преципитации, связывания комплемента, иммунофлюоресценции, нейтрализации вирусов на культурах клеток, куриных эмбрионах и жи­вотных, реакция торможения гемагглютинации.

Общие закономерности серологических реакций: 1) реакции ставятся in vitro; 2) проявляются при иммунологическом соответствии (гомологичности) антигена и антитела, в оптимальных температурных условиях и рН среды; 3) протекают в две фазы: а) взаимодействие антигена с антителом, или специфическая фаза; б) образование видимого невоору­женным глазом иммунного комплекса антитело–антиген, или неспеци­фическая фаза.

Для определения родовой, видовой и типовой принадлежности мик­робов иммунные диагностические сыворотки получают путем многократ­ного введения животным в нарастающих дозах убитых или живых мик­роорганизмов, продуктов их распада, токсинов и анатоксинов. Иногда Для активации антителообразования применяют адъюванты как стимуля­торы иммуногенеза.

После определенного цикла иммунизации животных проводят пробное кровопускание и определяют титр антител. Если в сыворотке содержится Достаточное количество антител, делают массивное кровопускание или тотальное обескровливание животного. Кровь, собранную в стерильную посуду, сначала помещают в термостат при температуре 37°С на 4–6 ч для ускорения свертывания, затем – на сутки в ледник. Полученную прозрачную сыворотку отсасывают в стерильную посуду, добавляют кон­серванты (мертиолат, хинозол), проверяют на стерильность и разливают в ампулы.

К диагностическим сывороткам относятся: 1) агглютинирующие бак­терии (корпускулы); 2) преципитирующие, предназначенные для вы­явления некорпускулярных антигенов; 3) гемолитическая, используемая в реакции связывания комплемента; 4) антитоксические и антивирусные, используемые для типирования токсинов и вирусов в реакции нейтрали­зации.

Выпускают также люминесцентные сыворотки, иммуноглобулины ко­торых метятся флюорохромами. Применяются они для ускоренной ди­агностики инфекционных болезней.

В качестве антигенов в серологических реакциях используют взвеси живых и убитых бактерий, продукты их расщепления, токсины, экстрак­ты тканей животных.

Реакция агглютинации

Агглютинацией называется склеивание бактерий при действии на них специфических антител в присутствии электролита. Ее используют.

1) для определения вида и серовара выделенных бактерий (серотипаж),

2) для обнаружения антител в сыворотке крови больного (серодиагнос­тика).

Для постановки реакции агглютинации (РА) необходимы три компо­нента: антиген (агглютиноген), антитело (агглютинин) и электролит (изотонический раствор натрия хлорида). В качестве антигена в РА применяют взвеси живых и убитых бактерий (диагностикумы).

Для получения агглютинирующих сывороток обычно иммунизируют кроликов. При этом им 5–7 раз подкожно, а затем внутривенно с интервалами 2–7 суток в возрастающих дозах вводят взвесь убитых, а в конце – 2 – 3 раза живых бактерий. Через неделю после иммунизации определяют титр сыворотки, или максимальное ее разведение, которое агглютинирует гомологичный микроорганизм. Если титр сыворотки не­достаточен, иммунизацию продолжают. Полученные таким образом аг­глютинирующие сыворотки называются неадсорбированными, поскольку содержат групповые агглютинины и могут в небольших разведениях склеивать родственные в антигенном отношении бактерии. Поэтому для определения вида бактерий надо ставить развернутую реакцию с сыво­роткой, разведенной от 1:100 до ее титра. Сыворотка соответствует микроорганизму в том случае, если как минимум агглютинирует его до половины титра.

Рис. 29 Реакция агглютинации: а – пластинчатая; б – развёрнутая.

Более достоверные результаты при определении вида или серовара бактерий дают адсорбированные (монорецепторные или типоспецифические) сыворотки, которые не имеют групповых агглютининов, вслед­ствие чего нет необходимости разводить их. Реакцию агглютинации в них ставят на предметном стекле.

Ориентировочная, или пластинчатая, реакция агглютинации. Ориен­тировочную РА выполняют перед постановкой развернутой реакции для того, чтобы отобрать на среде агглютинирующиеся в сыворотке колонии бактерий (культуры) и исключить из дальнейших исследований неагглютинирующиеся. Ставят ее при комнатной температуре на предметном стекле (рис. 29,а). Для этого на его поверхность пастеровской пипеткой раздельно наносят 2–3 капли различных сывороток в разведениях 1:10–1:20 и кап­лю 0,5 % раствора натрия хлорида (контроль РА). В каждую каплю за исключением контрольной вносят подозрительные колонии (петлю куль­туры) и тщательно перемешивают до равномерного помутнения.

Результаты реакции учитывают через несколько минут невооружен­ным глазом или с помощью лупы (х5). При положительной реакции в каплях с сывороткой появляются крупные или мелкие хлопья, при от­рицательной – жидкость остается равномерно мутной.

Развернутая реакция агглютинации для идентификации бактерий.

Ставят ее следующим образом. В агглютинационные пробирки предва­рительно разливают по 1 мл изотоничес­кого раствора натрия хлорида. В первую из них доливают 1 мл сыворотки, разве­денной 1:100, и, смешав ее, 1 мл перено­сят во вторую, из второй – в третью пробирку и т. д. Получив двукратные разведения сывороток (от 1:100 до 1:1600 и более), вносят в них по 1–2 капли двухмиллиардной взвеси бактерий. Кон­тролями служат изотонический раствор натрия хлорида с антигеном и исследуе­мая сыворотка без него. Пробирки энер­гично встряхивают и помещают на 2 ч в термостат при температуре 37С, затем ведут предварительный учет, начиная с контрольных. Отсутствие агглютинации в контрольных пробирках и наличие взве­шенных хлопьев в двух–трех и более про­бирках опыта свидетельствуют о положи­тельной реакции (рис. 29, б). Оконча­тельные результаты учитывают через 18–20 ч, выдерживая штатив с пробирками при комнатной температуре. Интенсивность реакции выражается плюсами: «++++» – сыворотка проз­рачная, с хлопьевидным осадком склеившихся бактерий на дне пробирки; «+++» «++» и «+» – убывающие просветления с уменьшением бак­териального осадка.

Реакция агглютинации для серодиагностики инфекционных болезней.

При использовании РА для выявления в сыворотке больных антител к соответствующему патогенному микробу или, как кратко говорят, в целях серодиагностики берут 5 мл крови, получают сыворотку и разводят ее изотоническим раствором натрия хлорида от 1:50–1:100 до 1:800–1:1600, так как в более низких ее титрах могут находиться нормальные агглютинины, имеющиеся у здоровых людей или у больных с другим диагнозом.

В качестве антигена в этой реакции используют заведомо известные взвеси убитых микроорганизмов (диагностикумы), с которыми безопасно работать

РА для серодиагностики ставится и учитывается так же, как и раз­вернутая РА для определения вида бактерий. Диагностическое значение имеют титры 1:100–1:200 и выше.

Более достоверные результаты дает выявление нарастания титра ан­тител в парных сыворотках, полученных от больного в начале заболе­вания и спустя 3–5 суток и более, когда титр агглютининов повышается под воздействием находящегося в организме патогенного микроба.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Ставится для обнару­жения полисахаридов, белков, экстрактов бактерий, микоплазм, риккетсий и вирусов, иммунные комплексы которых с агглютининами в обыч­ных классических РА увидеть не удается, или же для выявления антител в сыворотках больных к этим высокодисперсным веществам и мельчай­шим микроорганизмам.

РНГА для серодиагностики инфекционных болезней. Используя РНГА для обнаружения антител в сыворотках больных, готовят эритроцитарные антигенные диагностикумы. Для этого эритроциты обрабаты­вают 15 мин раствором танина в разведении 1:20 000–1:200 000, что придает им устойчивость и повышает адсорбционную способность. Затем их смешивают с известным антигеном и инкубируют в течение 2 ч при температуре 37С.. Сенсибилизированные антигеном эритроциты 2–3 раза отмывают 0,85 % раствором натрия хлорида и в количестве 0,10– 0,25 мл 0,5 % взвеси добавляют к сыворотке, разведенной от 1:10 до 1:1280 и разлитой по 0,25–0,50 мл в луночки плексигласовых панелей. Контролем служат взвеси интактных и нагруженных антигеном эритро­цитов, которые вносят в сыворотки, дающие заведомо положительную и отрицательную реакции.

Результаты реакции учитывают через 2 ч после инкубации в термостате и оценивают плюсами: «++++» – эритроциты равномерно покрывают всю лунку пластинки в виде зонтика с неровными краями; «+++», «++» –осадок эритроцитов в виде зонтика, в центре небольшое кольцо из осадка эритроцитов в виде зонтика, в центре небольшое кольцо из несклеивающихся эритроцитов; «+» – в основном несклеивающиеся эрит­роциты; «–» – скопление эритроцитов в виде маленького диска («пу­говицы»).

РНГА для выявления высокодисперсных антигенов. Готовят двукрат­ные разведения антигена в объеме 0,25–0,5 мл и к каждому из них добавляют 0,10–0,25 мл эритроцитов, сенсибилизированных антителами известной иммунной сыворотки. Результаты РНГА учитывают через 2 ч после инкубации в термостате и оценивают теми же плюсовыми значе­ниями.