Удалось ли вам успешно выделить и очистить зеленый флуоресцентный белок из клонированных бактериальных клеток? Обоснуйте ваш ответ.
Если пробирка #3 флуоресцирует зеленым, ученик успешно выделил белок. Если белка в пробирке нет, осмотрите колонку – может быть был нанесен не тот буфер ,и белок не смылся. Если исходная культура не была очень яркой, не следует ожидать очень яркого цвета в пробирке 3.
Очистка зеленого флуоресцентного белка (GFP)
Руководство для учеников
«Рекомбинантная ДНК была самым ценным по весу материалом в мире. Одна-единственная микроскопическая бактерия, невидимая невооруженным глазом, но несущая в себе ген фермента стрептокиназы, помогающего при инфаркте, или ген устойчивости злаков к заморозкам могла стоить 5 миллиардов долларов, если найти правильного покупателя.»
Майкл Крихтон «Парк Юрского периода»
Содержание
Урок 1 Обзор генетической трансформации: поиск светящейся зеленым молекулы
Урок 2 Инокуляция и выращивание бактериальной культуры
Урок 3 Первая стадия очистки: концентрирование и лизис бактерий
Урок 4 Вторая стадия очистки: удаление бактериального дебриса
Урок 5 Третья стадия очистки: хроматография белка
Урок 1: поиск светящейся зеленым молекулы
Обзор генетической трансформации
С помощью набора по трансформации бактерий pGLO, вы провели генетическую трансформацию E. coli плазмидой pGLO. В результате этой процедуры появились колонии клеток, способные флуоресцировать зеленым под ультрафиолетом, что не является нормальным фенотипом (характеристикой) для E. coli. Вас попросили придумать, как узнать, какая молекула отвечает за флуоресценцию. Так как вы определили, что ДНК плазмиды pGLO не флуоресцирует, вы сделали вывод, что за флуоресценцию отвечает не ДНК ,попавшая в клетки, а белок, кодируемый этой ДНК.
Белки
А. Что такое белок?
Б. Приведите три примера белков в составе вашего тела
В. Объясните взаимосвязь между генами и белками
Объясните своими собственными словами, что такое «клонирование»
Объясните чем бактериальные клетки в «библиотеке» отличаются от клеток в одной колонии
Опишите, как бы вы могли выделить белок, излечивающий от рака, из бактерий.
Урок 2: инокуляция и выращивание бактериальной культуры
Выбор колоний и выращивание бактериальной культуры
О
смотрите
две ваших чашки с трансформантами под
ультрафиолетом. Выберите отдельную
изолированную от других белую колонию
на чашке LB/amp
и обведите ее фломастером на дне чашки.
Найдите зеленую колонию на чашке
LB/amp/ara
и обведите ее. Обе ли эти колонии были
трансформированы плазмидой pGLO?
Почему вы так считаете?
Обе колонии содержат ген зеленого флуоресцентного белка. Чтобы выяснить это, вы должны посеять каждую из колоний в жидкую питательную среду и дождаться, пока бактерии не вырастут.
Ваша задача
В этой лабораторной работе вы выбираете одну белую колонию с чашки LB/amp и зеленую с чашки LB/amp/ara для посева в жидкие культуры. Так как предполагается, что клетки содержат зеленый флуресцентный белок и это тот белок, который мы хотим выделить, первое ваше соображение должно быть - как нарастить большое количество клеток ,вырабатывающих GFP.
Вам будут предоставлены две культуральных пробирки с питательной средой, в которые вы поместите клонированные клетки, трансформированные плазмидой pGLO.
Контрольный список () для ежедневной подготовки рабочих мест
Ваши рабочие места
Ниже приведены приборы и расходные материалы, которые должны быть на каждом
рабочем месте перед началом каждой экспериментальной работы
Рабочее место учителя (общее)
Список расходных материалов и оборудования, которые должны лежать в общем месте, доступном всей группе, также приведен ниже
Ваши рабочие места |
Число/на пару |
Чашки с трансформантами из набора по транформации бактерий pGLO (LB/amp и LB/amp/ara) |
2 |
Микробиологические петли |
2 |
Культуральные пробирки, содержащие по 2 мл жидкой среды |
2 |
Фломастер |
1 |
Штатив для микроцентрифужных пробирок |
1-4 |
|
|
Рабочее место учителя |
|
Микробиологическая качалка или шейкер (необязательно) |
1 |
УФ-лампа |
1-4 |
Экспериментальный протокол
Урок 2. Инокуляция и выращивание
бактериальной культуры
Осмотрите ваши чашки LB/amp и LB/amp/ara из работы по трансформации бактерий. Посмотрите на них при обычном освещение и под ультрафиолетом в темной комнате. Запишите, была ли разница.
Чтобы не повредить кожу или глаза, минимизируйте время работы с ультрафиолетом. Никогда не смотрите незащищенными глазами прямо на лампу. Если возможно, носите защитные очки.
Найдите несколько отдельных зеленых колоний на чашке LB/amp/ara и отдельную белых на чашке LB/amp. Обведите их фломастером с обратной стороне чашки.
Возьмите две культуральные пробирки со средой LB/amp/ara. Подпишите одну «+», другую «-». Возьмите стерильную петлю и мягко коснитесь петлей одной зеленой колонии, стараясь не царапать агар; потом опустите петлю в пробирку с надписью «+». Покрутите петлю между большим и указательным пальцами, чтобы суспендировать всю колонию. Повторите процедуру для белой колонии с чашки LB/amp. Очень важно, чтобы на петле были клетки только из одной отдельной колонии.
З акройте пробирки крышками и поместите их на качалку или шейкер на 24 часа при 32º или на двое суток при комнатной температуре. Если качалки в лаборатории нет, закройте пробирки и интенсивно потрясите, как баллончик с краской, не менее 30 секунд. Поместите в горизонтальном положении в термостат на 32º на 24 часа. Во время инкубации по мере возможности вытаскивайте и встряхивайте пробирки.
Условия культивирования |
Требуемое время |
32º, на качалке |
1 день |
32º, без перемешивания |
1-2 дня* |
Комнатная температура, на качалке |
2 дня |
Комнатная температура, без перемешивания |
Не рекомендуется |
*Пробирки нужно периодически встряхивать вручную и они должны лежать в термостате горизонтально
Вопросы к уроку 2
Что такое колония бактерий?
Зачем в работе нужно следующее оборудование?
А. УФ лампа
Б.Термостат
В. Качалка
Предположите ,что произойдет если вы возьмете одну из зеленых колоний с чашки LB/amp/ara и пересеете ее на чашку LB/amp? И наоборот, что произойдет если вы возьмете белую колонию с чашки LB/amp и пересеете ее на чашку LB/amp/ara? Объясните ваш ответ.
4. Объясните, как помещение клонированных клеток в питательную среду связано с вашей общей целью выделения GFP.
Урок 3 Первая стадия очистки: концентрирование и лизис бактерий
Итак, вы вырастили две культуры из двух клонированных бактерий. Каждая из них содержит ген зеленого флуоресцентного белка. Теперь нужно выделить белок из клеток, для этого сначала нужно подумать, как собрать эти клетки.
Хорошим способом сконцентрировать большое количество клеток это поместить пробирку с жидкой средой в центрифугу и открутить ее. Как вы предполагаете, где соберутся клетки – они будут плавать наверху, или осядут на дне?
Контрольный список () для ежедневной подготовки рабочих мест
Ваше рабочее место
Проверьте, что на вашем столе есть все нижеперечисленные расходные материалы и приборы перед началом работы.
Рабочее место учителя (общее)
Список расходных материалов и оборудования, которые должны лежать в общем месте, доступном всем ученикам, также приведен ниже.
Урок 3 |
|
Рабочие места учеников |
Число/на пару |
Микроцентрифужные пробирки |
1 |
Пипетки |
1 |
Штатив для микроцентрифужных пробирок |
1 |
Фломастер |
1 |
Стакан с водой для промывания пипеток |
1 |
Рабочее место учителя |
|
Буфер ТЕ |
1 бутылка |
Лизоцим (регидратированный) |
1 флакон |
Центрифуга |
1 |
УФ-лампа |
1-4 |