Разлейте жидкую питательную среду

Взяв чистую пипетку, разлейте по 2 мл среды в 16 пробирок (добавьте два раза по 1 мл). Храните эти пробирки со средой в холодильнике до тех пор, пока они вам не понадобятся. В наборе содержатся девять дополнительных пробирок. Вы можете наполнить их средой и использовать в демонстрационных целях или как запасные для тех учеников, у которых что-то не получится.

Для урока 2, каждой паре понадобятся две культуральные пробирки, по 2 мл жидкой питательной среды в каждой. В этом уроке ученики инокулируют свои 2 мл культуры трансформантами из набора по трансформации бактерий pGLO.

Замечение: в идеале, культуры должны выращиваться сутки при температуре 32º и перемешиваться в режиме 40-200 об/мин. Перемешивание способствует поступлению кислорода в среду к делящимся клеткам, и чем оно лучше, тем лучше клетки растут. Обычно для этого используется микробиологическая качалка. Можно также плотно закрыть пробирки и поместить их на шейкер внутрь обычного термостата, установленного на 32º. Если такие приборы недоступны, культуры клеток можно встряхнуть вручную в течение 30 сек и потом растить сутки на 32º. Просто пусть ваши ученики потрясут культуры в течение 30 секунд так, как бы они встряхивали баллончик с краской. Чем интенсивнее будет встряхивание, тем лучше будет рост клеток и тем больше GFP образуется. После встряхивания положите пробирки набок внутрь термостата, установленного на 32º на 1-2 дня. Когда пробирки расположены горизонтально, большая поверхность среды находится в контакте с воздухом, что увеличивает диффузию кислорода внутрь клеток. Периодически встряхивайте пробирки в течение двухдневной инкубации.

Если термостата нет, клетки за два дня вырастут и при комнатной температуре. Однако в этом случае надо использовать качающуюся платформу или шейкер. Не рекомендуется растить культуры без перемешивания при комнатной температуре. После требуемого инкубационного периода, культуры инокулированные как белыми, так и зелеными колониями должны выглядеть ярко-зелеными под ультрафиолетовым светом.

Урок 3 Первая стадия очистки: концентрирование и лизис бактерий

Предварительная подготовка

Задачи	Подготовить рабочие места
	Растворить лизоцим
	Подготовить центрифугу
Требуемое время	10 минут

Растворите содержимое флакона с лизоцимом, добавив туда 1 мл ТЕ чистой пипеткой. Аккуратно перемешайте. Сохраняйте раствор на льду или в холодильнике до использования.

Урок 4 Вторая стадия очистки: удаление бактериального дебриса

Задачи	Подготовить рабочие места (единственная требуемая подготовка)
	Подготовить центрифугу
Требуемое время	10 минут

Урок 5 Третья стадия очистки: хроматография белка

Задачи	Подготовить рабочие места (единственная требуемая подготовка)
Требуемое время	10 минут

Если колонки высохли, они могут быть легко регидратированы следующим образом: вылейте смолу в стаканчик или другой подходящий сосуд и добавьте воду так, чтобы получилась суспензия. Потом перелейте суспензию обратно в колонку. Слейте воду и уравновесьте колонку буфером для связывания.

Важные разделы уроков

В этой секции описаны моменты, которые могут вызывать затруднения, или моменты, которые являются чрезвычайно важными для получения результата и для общего понимания всех экспериментов. Преподаватели должны обратить внимание своих учеников на эти вопросы и, если это возможно, продемонстрировать выполнение процедуры, перед тем, как ученики попробуют это сделать сами. Руководство для учеников содержит подробные картинки и описание всех экспериментальных шагов и процедур для уроков со второго по пятый. Обращайтесь к нему, если вам что-то непонятно в экспериментальных протоколах.

Использование пипетки

Перед началом лабораторных занятий, покажите ученикам градуировки на пипетке. В качестве единицы измерения в течение работы будет применяться как 250 мкл так и 1 мл

Урок 1 Обзор генетической трансформации

Питательная среда

Жидкая и агаризованная среда LB (Лурия-Бертани) сделана из дрожжевого экстракта и гидролизата мясных субпродуктов и представляет собой смесь углеводов, аминокислот, нуклеотидов, солей и витаминов, необходимых для роста бактерий. Агар, который производится из водорослей, расплавляется при нагревании, а когда остывает, образует твердый гель, напоминающий желе. Он функционирует в качестве подложки, на которой растут бактерии.

Отбор на устойчивость к антибиотикам

Плазмида pGLO, содержащая ген зеленого флуоресцентного белка, также содержит ген бета-лактамазы, фермента, дающего бактериям устойчивость к антибиотику ампициллину. Бета-лактамаза производится и выбрасывается наружу бактериями, содержащими плазмиду. Секретированная бета-лактамаза инактивирует ампициллин, что позволяет только трансформированным клеткам расти в его присутствии (См. схему ниже).