Плазмиды это маленькие кольцевые молекулы днк
Плазмиды это маленькие кольцевые ДНК, находящиеся в клетках многих бактерий. Они реплицируют себя с помощью ферментов клетки, в которой находятся. Поэтому они могут находиться неограниченно долго в клетке, существуя там фактически как паразиты.
Благодаря их маленькому размеру, плазмидные ДНК легко выделить из бактериальных клеток. Их можно разрезать рестриктазами и сшить с любой чужеродной ДНК, разрезанной теми же рестриктазами. Получившаяся в результате рекомбинантная плазмида может быть перенесена обратно в бактериальную клетку в процессе трансформации. Рекомбинантные плазмиды реплицируют себя и при этом реплицируется встроенный в них чужеродный ген, каждая плазмида несет его точную копию. Мы говорим, что ген был «клонирован»; плазмида, несущая ген называется «вектором».
Плазмиды не только могут быть использованы для клонирования чужих генов, зачастую они несут свои собственные. Например, известны гены устойчивости к антибиотикам, которые позволяют бактериям выживать и размножаться в присутствии определенных антибиотиков; например, бета-лактамаза придает устойчивость к ампициллину и другим производным пенициллина. Такие гены часто распространяются между бактериями на плазмидах. Когда в плазмиду встраивается чужеродная ДНК и эта плазмида трансформирует клетку, гены устойчивости к антибиотикам позволяют легко отобрать те бактерии, которые получили плазмиду – в присутствии антибиотика все остальные бактерии погибнут.
Библиотеки днк
ДНК, выделенная из клетки любого организма, может быть порезана на куски, а эти куски все вместе помещены в плазмиды, так что одна плазмида содержит один кусочек исходной ДНК. Таким образом, создается популяция рекомбинантных плазмид. Далее эти плазмиды помещаются в бактерии, причем внутрь каждой клетки попадает одна-единственная плазмида, которая потом многократно копируется. Таким образом, все клетки содержат одинаковую ДНК вектора, но разные ДНК «вставок». Если исходная ДНК была порезана на 1000 кусков, образовалось 1000 рекомбинантных молекул и 1000 трансформированных клеток, каждая из которых содержит 1 кусочек исходной ДНК. Такой набор клеток называется библиотекой ДНК. Интересующие нас участки могут быть найдены в библиотеке с помощью соответствующих проб (комплементарных молекул ДНК)
Приложение С
Техника стерильной работы
Выполняя любые микробиологические эксперименты, важно не занести бактерий из внешней среды. Так как бактерии находятся везде – на кончиках пальцев, на поверхности стола, в воздухе и.т.п. важно минимизировать контакт образцов с окружающей средой. Когда ученики работают с петлями, пипетками или чашками Петри, вы должны подчеркнуть, что к кончику петли, носику пипетки или поверхности чашки нельзя прикасаться ни при каких обстоятельствах. Несмотря на то, что небольшое загрязнение вряд ли сильно повлияет на этот эксперимент, привычка к чистой работе в будущем пригодится ученикам. Использование стерильной техники это так же и вопрос человеческого здоровья и гигиены.
Приложение D
Регуляция работы генов. Один ген - один белок
Наши тела содержат тысячи разных белков, выполняющих разные задачи. К белкам относятся и пищеварительные ферменты, и гормоны, и антитела, защищающие нас от болезней. Информация, необходимая для сборки конкретного белка закодирована в ДНК. Участок ДНК, несущий код конкретного белка, называется геном. Совокупность всех генов человека (это более 100 000 генов) называется геном. Каждый ген кодирует уникальный белок, по принципу один ген – один белок. Ген, который кодирует пищеварительный фермент в составе слюны, отличается от гена, кодирующего антитело или гена, кодирующего пигмент глаз.
Организмы регулируют экспрессию генов и в конечном итоге количество и виды белков, содержащихся в клетке. Работа генов все время меняется по множеству причин: при развитии и специализации клетки, для приспособления к условиям окружающей среды. Регуляция работы генов не только позволяет адаптироваться к меняющим условиям, но и препятствует выработке ненужных в данный момент белков, чтобы не тратить на это ресурсы. Лишние затраты ставят клетку в невыгодное положение относительно других. Гены, вовлеченные в транспорт и переработку (катаболизм) пищи, являются хорошими примерами генов со сложной регуляцией. Например, сахар арабиноза может быть использован E. coli в качестве источника энергии и углерода. Бактерии производят три белка ( фермента), необходимых для переработки арабинозы. Гены, кодирующие эти белки, не экспрессируются в отсутствие арабинозы, но начинают работать, когда арабиноза появляется в окружающей среде. Как так получается?
Регуляция экспрессии белков обычно протекает на стадии транскрипции, когда на матрице ДНК синтезируется РНК. Регуляция происходит в специальном участке ДНК, называемом промотором, где РНК-полимераза связывается с ДНК и начинает транскрипцию. У бактерий связанные по функции гены часто расположены рядом друг с другом и транскрибируются с одного промотора. Такие группы генов, управляемые одним промотором, называются оперонами.
Три гена (araB, araC, araD) кодирующие три фермента, вовлеченных в распад арабинозы, собраны у E. coli вместе в так называемый арабинозный оперон. Транскрипция этих трех генов начинается с одного промотора, (PBAD). Для начала транскрипции необходимо присутствие матрицы ДНК, РНК полимеразы, белка AraC и арабинозы. AraC связывается с ДНК в месте посадки РНК-полимеразы перед началом оперона. Когда арабиноза появляется в окружающей среде, бактерии траспортируют ее внутрь. Попав в клетку, арабиноза непосредственно взаимодействует с AraC, связанным с ДНК. Это взаимодействие заставляет AraC изменить свою конформацию (форму) так, что он помогает РНК-полимеразе связаться с ДНК и начинается транскрипция трех генов, A, B и D. Три фермента производятся, выполняют свою работу, и, предположим, через какое-то время арабиноза заканчивается. Тогда AraC изменяет конформацию обратно и транскрипция выключается.
Плазмида pGLO включает в себя некоторые участки арабинозного оперона. В ней присутствуют промотор PBAD и ген araC, а гены, кодирующие белки, отвечающие за разложение арабинозы (A, B и D), заменены на ген зеленого флуоресцентного белка (GFP). Таким образом, в присутствии арабинозы, AraC способствует связыванию РНК-полимеразы с промотором и идет транскрипция GFP. По мере накопления белка, клетки начинают флуоресцировать ярко-зеленым. Если арабинозы в среде нет, AraC не облегчает связывание РНК-полимеразы и ген GFP не транскрибируется. Когда GFP не производится, клетки имеют дикий фенотип - они белые и не флуоресцируют под ультрафиолетом.
Все вышесказанное является примером центральной догмы молекулярной биологии в действии: ДНК->РНК->БЕЛОК->ПРИЗНАК
