
- •Вопросы безопасности
- •Общий план подготовки для учителей
- •Подготовка преподавателей к лабораторной работе
- •Приготовьте жидкую питательную среду
- •Разлейте жидкую питательную среду
- •Промотор – участок днк, с которого начинается транскрипция мРнк. Активация транскрипции с какого-либо промотора в конечном итоге приводит к синтезу белка. См. Приложение d
- •Ночные жидкие культуры
- •Урок 5 Третья стадия очистки: хроматография белка
- •Гидрофобная хроматография
- •Нанесение содержащего gfp супернатанта на колонку
- •Удалось ли вам успешно выделить и очистить зеленый флуоресцентный белок из клонированных бактериальных клеток? Обоснуйте ваш ответ.
- •Экспериментальный протокол к уроку 3
- •Вопросы к уроку 3
- •Урок 4 Вторая стадия очистки: удаление бактериального дебриса
- •Экспериментальный протокол для урока 4
- •Вопросы к уроку 5
- •Линейный код, трехмерные последствия
- •Гены это отдельные «файлы» генетической информации
- •Плазмиды это маленькие кольцевые молекулы днк
- •Библиотеки днк
Линейный код, трехмерные последствия
Первичным хранилищем информации во всех живых клетках является ДНК. Эта информация закодирована в виде линейной последовательности букв «А», «Т», «Г», «Ц» вдоль цепи ДНК. Этот линейный код может быть передан потомству – за счет механизма точного копирования молекул ДНК.
В каждый конкретный момент некоторые участки ДНК транскрибируются. Такие участки называются «генами». РНК-полимераза копирует весь фрагмент, основание за основанием, синтезируя полностью комплементарную цепь РНК, состоящую из букв «А», «Г», «Ц», «У».
ДНК не только является матрицей для копирования, но и предоставляет информацию о том, где транскрипция должна начинаться («промотор») и где заканчиваться; сколько нужно сделать копий и в какой момент; и даже – в виде структуры синтезированной РНК- информацию о стабильности и продуктивности этой РНК!
Существует три основных класса РНК, транскрибируемых с матриц ДНК: это матричные РНК (мРНК), которые содержат информацию для сборки белков; транспортные РНК (тРНК), которые помогают собирать белки и рибосомальные РНК (рРНК) которые являются важнейшими структурными компонентами рибосомы, «фабрики» по сборке белков и катализируют саму реакцию синтеза полипептидной цепи.
мРНК содержат информацию для изготовления белков. В ходе процесса «трансляции», рибосомы переводят эту информацию, закодированную в последовательности нуклеотидов, в последовательность аминокислот в белке. Как они это делают? Ведь существует всего четыре вида нуклеотидов, но более 20 видов аминокислот!
Во время трансляции рибосома считывает нуклеотиды по три сразу, и приписывает каждому «триплету» соответствующую аминокислоту (триплеты часто называют «кодонами»). Каждая следующая аминокислота присоединяется на конец растущей белковой цепи. Существует всего 64 возможных кодона (столько возможно комбинаций из 4 букв по 3), это в несколько раз больше, чем число возможных аминокислот, поэтому сразу несколько кодонов соответствуют одной и той же аминокислоте. Это дает коду определенный запас «устойчивости».
Таким образом, информация, кодированная в линейной последовательности ДНК, используется для того, чтобы собрать линейную последовательность белка. В свою очередь, эта линейная последовательность определяет точную пространственную форму, которую примет белок и его особые химические свойства.
Подводя итог, основной путь передачи информации в клетке таков:
ДНК>>>РНК>>>БЕЛОК>>>ПРИЗНАК
Хотя код линейный, его последствия трехмерные. Основа технологии рекомбинантной ДНК в том, что манипуляции с линейной последовательностью ДНК приводят к желательным постоянным изменениям жизнедеятельности клеток.
Гены это отдельные «файлы» генетической информации
Ген это фрагмент ДНК, с которого транскрибируется РНК. Прямо или косвенно, эта РНК будет выполнять какую-то функцию, поэтому правильно думать о гене, как о единице функции.
Многие признаки, например, устойчивость к антибиотикам, закодированы одиночными генами. Однако большинство признаков, например, форма носа или цвет розы, являются следствием согласованной работы нескольких генов.
Гены могут иметь разную длину: от нескольких сотен до десятков тысяч пар оснований. На одной молекуле ДНК может находиться от десятка до многих тысяч генов. В свою очередь, в клетке может находиться одна или множество молекул ДНК (хромосом). В целом, число генов в клетке очень сильно варьирует. Например, бактерия E. coli содержит одну молекулу ДНК на которой расположено примерно 5 000 генов. Клетка человека содержит 46 молекул ДНК (хромосом) на которых в сумме расположено около 100, 000 генов.
Не все гены, содержащиеся в клетке, транскрибируются с образованием РНК (экспрессируются), в одно время и с одинаковой скоростью. Когда говорят о работе генов, говорят об «уровне экспрессии». Этот уровень контролируется клеткой в соответствии с определенными правилами, в свою очередь закодированными в ДНК.
Например, все клетки нашего тела (все 100 триллионов) содержат одинаковые молекулы ДНК. Тем не менее, клетки печени экспрессируют лишь те гены, которые нужны для функционирования печени, а клетки кожи экспрессируют совсем другой набор генов!
ДНК может быть порезана на части с помощью ферментов рестрикции (рестриктаз)
Рестрикционные ферменты, или рестриктазы, синтезируются бактериями для защиты от чужеродной ДНК, например, вирусной. Эти ферменты узнают короткие последовательности ДНК (4-6 пар оснований) и разрезают все молекулы ДНК, в которых встречается эта последовательность. Например, рестриктаза BamHI (читается «Бам-аш-один») узнает последовательность 5`…ГГАТЦЦ…3` и разрезает молекулу ДНК между двух Г в месте узнавания. Рестриктазы могут разрезать ДНК любого происхождения, бактериальную, растительную или животную, главное, чтобы там была последовательность узнавания (сайт рестрикции).
Куски ДНК могут быть сшиты с помощью ДНК-лигазы
Д
НК-лигаза
это фермент, сшивающий два куска ДНК,
если их концы взаимно совместимы. Так,
кусок человеческой, или лягушачьей, или
ДНК помидора, разрезанной рестриктазой
BamHI
может быть легко сшит с бактериальной
ДНК, если она была также разрезана BamHI.
Соединяя молекулы ДНК разного
происхождения, можно создавать
рекомбинантные (гибридные) ДНК.
Гены из разных организмов можно переместить в бактерии. Например, можно поместить в бактерии человеческий ген гормона инсулина. В определенных условиях эти бактерии будут синтезировать полностью идентичный человеческому инсулин!
лигаза