Набор для очистки зеленого флуоресцентного белка (GFP)

Учебное руководство

Полный курс обучения

Наборы и учебные материалы Biotechnology Explorer разрабатывались на протяжении последних пяти лет учителями и для учителей и были опробованы в школах и ВУЗах. Простые в использовании наборы Biotechnology Explorer - это лучший способ познакомить ваших учеников с современными достижениями в области биотехнологий. Каждый набор содержит пошаговую инструкцию и может быть использован как опытными, так и начинающими преподавателями.

Учебные материалы, содержащиеся в каждом наборе, делают нашу продукцию уникальной. Каждый набор представляет из себя индивидуальный учебный комплект, состоящий из двух частей: руководство для преподавателей и руководство для учеников. Материалы для учителей представлены тремя секциями. Первая секция содержит вводную информацию, темы, которые необходимо затронуть и ссылки, которые позволят преподавателям подготовить уроки и лекции в рамках лабораторной работы. Тщательная предварительная подготовка является гарантией отсутствия проблем во время работы и гарантией того, что ученики поймут идеи, лежащие в ее основе.

Вторая секция описывает подготовку к экспериментальной части. Подробные описания всех этапов работы, снабженные рисунками, практически исключают вероятность совершения ошибки. Помимо этого, в каждой секции указано примерное время выполнения каждой задачи, что поможет вам спланировать ваше расписание. Каждая лабораторная работа может быть выполнена за 50 мин.

В третьей секции вы сможете найти подробные ответы на вопросы, содержащиеся в руководстве для учеников. Учитель может руководствоваться этими ответами, оценивая ответы своих учеников.

Каждый набор создан для того, чтобы максимально вовлечь ученика в практическую работу и в обсуждение теоретических вопросов. Вовлечение учеников в процесс позволяет привить им интерес к научной работе, основанной на логически выстроенным подходе к решению задач. Ученики, прошедшие данный курс обучения, начинают лучше понимать процесс получения научных результатов.

Для того, чтобы лабораторная работа принесла максимальную пользу вашим ученикам, они должны иметь представление, о том, что такое ген и понимать взаимосвязь между генами и белками. Более подробное обсуждение этой и других основных концепций молекулярной биологии вы сможете найти в приложении B.

Содержание

Руководство для преподавателей 5

Контрольный список() содержания набора 5

Вопросы безопасности 6

Предполагаемый план уроков 7

Общий план подготовки для учителей 7

Контрольный список () для ежедневной подготовки рабочих мест 8

Подготовка преподавателей к лабораторной работе 10

Урок 2 Инокуляция и выращивание бактериальной культуры 10

Урок 3 Первая стадия очистки: концентрирование и лизис бактерий 12

Урок 4 Вторая стадия очистки: удаление бактериального дебриса 12

Урок 5 Третья стадия очистки: хроматография белка 12

Важные разделы уроков 13

Урок 1 Обзор генетической трансформации 13

Урок 2 Инокуляция и выращивание бактериальной культуры 15

Урок 3 Первая стадия очистки: концентрирование и лизис бактерий 16

Урок 4 Вторая стадия очистки: удаление бактериального дебриса 17

Урок 5 Третья стадия очистки: хроматография белка 18

Очистка GFP - краткое руководство в картинках 21

Ответы на вопросы для преподавателей 24

Руководство для учеников 30

Урок 1: поиск светящейся зеленым молекулы 31

Урок 2: инокуляция и выращивание бактериальной культуры 31

Урок 3 Первая стадия очистки: концентрирование и лизис бактерий 35

Урок 4 Вторая стадия очистки: удаление бактериального дебриса 38

Урок 5 Третья стадия очистки: хроматография белка 41

Приложение А 45

Приложение B 47

Приложение С 54

Приложение D 54

Найти иголку в стоге сена легче, если она светится

Это лабораторная работа выполняется вслед за экспериментом по трансформации бактерий плазмидой pGLO. Трансформированные бактерии, производящие зеленый флуоресцентный белок (Green Fluorescent Protein, GFP) засеваются в питательную среду. Затем бактериальные клетки разрушаются (лизируются), высвобождая содержащийся в них GFP. Белок очищается от бактериального дебриса (остатков клеток) с помощью одноразовых хроматографических колонок, содержащихся в этом наборе. Способность GFP к флуоресценции позволяет сделать весь процесс выделения наглядным.

Одно из главных средств современной биотехнологии – рекомбинация ДНК ( разрезание и сшивание разных молекул ДНК друг с другом). Основная идея заключается в том, что можно вырезать фрагмент ДНК (ген) из одного организма и соединить его с ДНК другого организма-реципиента. Таким образом, реципиент будет нести генетические инструкции, содержащиеся в приобретенном фрагменте ДНК. Например, в растения могут быть встроены гены, придающие им устойчивость к вредителям или болезням. Известно несколько удачных попыток лечения наследственных заболеваний, связанных с дефектами определенных генов (такие как муковисцидоз), с помощью доставки пациентам с нефункциональными генами нормальных копий этих же генов.

Гены людей, животных или растений могут быть перемещены в бактерии. Например, ген человеческого гормона инсулина может быть помещен в бактерию.. Выращивание бактерий в гигантских чанах (ферментерах) позволяет производить инсулин в промышленных масштабах. Такой «рекомбинантный» инсулин очищается с помощью белковой хроматографии и используется для лечения больных диабетом, генетическим нарушением, при котором не вырабатывается инсулин.

Распространенная проблема при выделении рекомбинантных белков из бактерий - это загрязнение бактериальными белками. Для очистки интересующих нас белков и отделения их от бактериальных в промышленности применяется мощный инструмент – хроматография. Белки, очищенные таким способом, используются в медицине и в быту, как например ферменты в составе стиральных порошков.

Клонирование и экспрессия гена GFP и следующая за ним процедура выделения белка полностью аналогичны процедурам, применяющимся в промышленности для выделения и очистки коммерчески важных белков. Природным хозяином гена зеленого флуоресцентного белка является медуза Aequoria victoria.

«Рекомбинантная ДНК была самым ценным по весу материалом в мире. Одна-единственная микроскопическая бактерия, невидимая невооруженным глазом, но несущая в себе ген фермента стрептокиназы, помогающего при инфаркте, или ген устойчивости злаков к заморозкам могла стоить 5 миллиардов долларов, если найти правильного покупателя» - Майкл Крихтон «Парк Юрского периода»

Руководство для преподавателей

Контрольный список() содержания набора

В этом разделе перечислены все компоненты, входящие в состав набора по очистке зеленого флуоресцентного белка и требуемые дополнительные принадлежности. Каждый набор рассчитан на восемь рабочих мест для учеников. Проверьте с помощью этого списка, все ли у вас есть, перед тем как начать работу.

Компоненты в составе набора	Число/на один набор	()
Ампициллин, лиофилизованный	1 флакон	
Арабиноза, лиофилизованная	1 флакон	
Сухая среда LB (на 50 мл среды)	1 таблетка	
Микробиологические петли, упаковки по 10 петель	2 упаковки	
Стерильные пипетки в индивидуальной упаковке	40	
Микроцентрифужные пробирки, 2.0 мл, прозрачные	30	
Культуральные пробирки, 15 мл, стерильные (упаковка 25 шт)	1 упаковка	
Пробирки для сбора фракций, 5 мл, полистирол	25	
Буфер TE (10 mM Tris, 1mM EDTA, pH 8.0)	1 бутылка	
Лизоцим, лиофилизованный	1 флакон	
Буфер для связывания (4M NH4SO4/TE, pH 8.0)	1 бутылка	
Буфер для уравновешивания колонки (2M NH4SO4/TE, pH 8.0)	1 бутылка	
Буфер для промывки колонки (1.3M NH4SO4/TE, pH 8.0)	1 бутылка	
Колонки для гидрофобной хроматографии	8 колонок	
Крышки для колонок	1 пакет	
Необходимые дополнительные принадлежности	Число/на класс	()
Чашки с трансформантами (из набора по трансформации бактерий pGLO LB/amp и LB/amp/ara)	2	
УФ лампа, длинноволновая	1-4	
Центрифуга	1	
Микроволновая печь	1	
Колба на 250 мл	1	
Градуированный цилиндр на 100 мл	1	
Дистиллированная вода	100 мл	
Стакан с водой для промывания пипеток	1	
Фломастеры	8	
Морозилка	1	
Штативы для микроцентрифужных пробирок	8	
Опциональные компоненты
Микробиологическая качалка или шейкер. Использование качалок ускорит рост бактерий в жидкой культуре, но не является обязательным.	1	
Термостат	1	
Коробки для хранения микроцентрифужных пробирок	8	

Вопросы безопасности

Штамм Escherichia coli HB101 K-12 входящий в состав этого набора это не патогенный микроорганизм (в отличие от штамма E. coli H157:07 иногда вызывающего пищевые отравления). HB101 K-12 генетически модифицирован таким образом, чтобы расти только на специальной обогащенной среде. Тем не менее, обращение с этим штаммом требует соблюдения стандартных микробиологических процедур. Эти процедуры включают в себя следующее: раз в день или при разлитии биологического материала все рабочие поверхности обеззараживаются; все зараженные жидкие или твердые отходы обеззараживаются перед утилизацией; все ученики и преподаватели должны мыть руки после каждого контакта с содержащего бактерии материалом и перед выходом из лаборатории. Все процедуры должны выполняться аккуратно, чтобы не вызывать возникновения аэрозолей. Для пользования пипеткой должны применяться механические устройства, набирать растворы ртом запрещено. Запрещено есть, пить, курить и пользоваться косметикой в рабочем помещении. Рекомендуется использование защитных очков и перчаток.

При отсутствии автоклава, все растворы и принадлежности (петли и пипетки), входившие в контакт с бактериями, помещаются по меньшей мере на 20 мин в 10% раствор хлорки для стерилизации. Ванночка с таким раствором должна стоять в каждом рабочем помещении. Все использованные петли и пипетки должны быть собраны для стерилизации. Для стерилизации чашек Петри они покрываются сверху 10% раствором хлорки и выдерживаются как минимум час, после этого жидкость выливается в канализацию, а чашки заворачиваются и далее рассматриваются как обычный мусор. При работе с раствором хлорки рекомендуется использование защитных очков.

Ампициллин может вызывать аллергические реакции или раздражение глаз, дыхательных путей и кожи. В случае попадания в глаза, немедленно промойте их большим количеством воды и обратитесь за медицинской помощью. Используйте подходящие средства защиты. Ампициллин является антибиотиком семейства пенициллина, если у кого-то из учащихся есть аллергия на пенициллин или на другой пенициллиновый антибиотик, он должен избегать контакта с ампициллином.

Более подробную информацию и данные по безопасности (MSDS) для компонентов набора вы можете узнать на сайте компании www.bio-rad.com. Используйте ваши местные законы и нормативы для правильной утилизации отходов.

УФ лампа

Ультрафиолетовое излучение может вызывать ожоги глаз и кожи. Коротковолновое УФ-излучение более опасно, чем длинноволновое. Используйте длинноволновую УФ лампу для этой работы. Если возможно, используйте защитные очки, не пропускающие УФ (обычное кварцевое стекло также задерживает УФ).

Предполагаемый план уроков

Учебный курс по очистке зеленого флуоресцентного белка включает 5 уроков, в том числе четыре лабораторных занятия. Каждый урок рассчитан на 50 минут. Для непрерывного протекания работы, ее можно начать в понедельник и закончить в пятницу. Пошаговые инструкции по выполнению экспериментов приведены в руководстве для учеников.

Урок 1 Введение, лекция и обсуждение

Урок 2 Выбор колоний и инокуляция бактериальных культур

Урок 3 Первая стадия очистки: концентрирование и лизис бактерий

Урок 4 Вторая стадия очистки: удаление бактериального дебриса

Урок 5 Третья стадия очистки: хроматография белка